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外泌体负载的miR-520a-5p对胎鼠宫内生长受限妊娠结局的改善作用及其机制
1
作者 相萌 徐冰 +2 位作者 王培莎 刘思旗 张少华 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第5期1230-1239,共10页
目的:探讨外泌体(Exos)负载的微小RNA-520a-5p(miR-520a-5p)对胎鼠宫内生长受限(FGR)妊娠结局的影响,并阐明其作用机制。方法:体外培养小鼠胎盘间充质干细胞(MSCs),并利用miR-520a-5p腺病毒载体(Ad-miR-520a-5p)转染获得高负载miR-520a... 目的:探讨外泌体(Exos)负载的微小RNA-520a-5p(miR-520a-5p)对胎鼠宫内生长受限(FGR)妊娠结局的影响,并阐明其作用机制。方法:体外培养小鼠胎盘间充质干细胞(MSCs),并利用miR-520a-5p腺病毒载体(Ad-miR-520a-5p)转染获得高负载miR-520a-5p的Exos(miR-520a-5p-MSCs-Exos)并进行鉴定。C57BL/6小鼠按照雌雄2∶1的比例合笼交配成功妊娠,将40只怀孕小鼠分为对照组、FGR组、NC-MSCs-Exos组和miR-520a-5p-MSCs-Exos组,每组10只。除对照组外,其余组小鼠采用孕期过度暴露地塞米松(DEX)诱发妊娠期母体小鼠的FGR模型。检测胎鼠出生体质量和生后1、2、3及4周体质量,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测各组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达水平,Western blotting法检测各组小鼠胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平,甲基化特异性PCR(MSP)分析各组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率,双荧光素酶报告基因实验验证miR-520a-5p与DNMT3b之间的靶向关系。结果:透射电子显微镜(TEM)和纳米粒子追踪分析(NTA)分析,Exos呈球形,粒径集中在100 nm附近;Western blotting法,Exos表面生物标志物CD63和CD81均呈阳性表达;RT-qPCR法,与NC-MSCs-Exos和Ad-NC-MSCs-Exos比较,Ad-miR-520a-5p-MSCs-Exos中miR-520a-5p表达水平升高(P<0.001)。4组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量比较差异均有统计学意义(F=36.084,F=19.851,F=77.755,F=103.223;P<0.001)。与对照组比较,FGR组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量均降低(P<0.05);与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较,miR-520a-5p-MSCs-Exos组子代小鼠出生体质量和生后1、2及3周体质量均升高(P<0.05)。单因素方差分析,4组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p、DNMT3b和VEGF mRNA表达水平比较差异有统计学意义(F=103.224,F=856.460,F=214.563;P<0.001);组间两两比较,与对照组比较,FGR组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p和VEGF mRNA表达水平降低(P<0.05),DNMT3b mRNA表达水平升高(P<0.05);与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较,miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中miR-520a-5p和VEGF mRNA表达水平升高(P<0.05),DNMT3b mRNA表达水平降低(P<0.05)。单因素方差分析,4组小鼠胎盘组织中DNMT3b和VEGF蛋白表达水平比较差异有统计学意义(F=245.601,F=149.360;P<0.001);组间两两比较,与对照组比较,FGR组小鼠胎盘组织中DNMT3b蛋白水平升高(P<0.05),VEGF蛋白表达水平降低(P<0.05);与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较,miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中DNMT3b蛋白表达水平降低(P<0.05),VEGF蛋白表达水平升高(P<0.05)。单因素方差分析,4组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率比较差异有统计学意义(F=687.096,P<0.001);组间两两比较,与对照组比较,FGR组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率升高(P<0.05);与FGR组和NC-MSCs-Exos组比较,miR-520a-5p-MSCs-Exos组小鼠胎盘组织中VEGF启动子甲基化率降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验,与miR-NC组比较,miR-520a-5p组DNMT3b-WT报告载体细胞的荧光素酶活性明显降低(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-520a-5p组DNMT3b-MUT报告载体细胞的荧光素酶活性无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:高负载miR-520a-5p的MSCs来源的Exos可能通过靶向下调DNMT3b表达,抑制VEGF甲基化,促进VEGF表达,改善FGR胎鼠妊娠结局。 展开更多
关键词 胎儿宫内生长受限 外泌体 间充质干细胞 微小RNA-520a-5p DNA甲基转移酶3B 血管内皮生长因子
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沉默调节蛋白3通过mTOR信号途径调节溶酶体功能抑制U87细胞凋亡 被引量：2
2
作者 张旭东 单李天一 +6 位作者 王蓉 刘树义 兰凯 陈敏 廉婷 李凯 Rajiv Kumar JHA 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第18期1916-1926,共11页
目的探讨沉默调节蛋白3(sirtuin 3,Sirt3)在胶质瘤细胞U87中的作用,为胶质瘤的早期诊治提供新靶点。方法基于中国脑胶质瘤数据库(CGGA)、GEPIA2数据库,通过生物信息学分析Sirt3在胶质瘤不同分级的表达情况,通过Western blot检测6位胶质... 目的探讨沉默调节蛋白3(sirtuin 3,Sirt3)在胶质瘤细胞U87中的作用,为胶质瘤的早期诊治提供新靶点。方法基于中国脑胶质瘤数据库(CGGA)、GEPIA2数据库,通过生物信息学分析Sirt3在胶质瘤不同分级的表达情况,通过Western blot检测6位胶质瘤患者癌旁与肿瘤组织中Sirt3的蛋白水平。利用shRNA慢病毒、CRISPR/Cas9系统干预U87细胞Sirt3的表达,采用TUNEL染色、PI-Annexin V双荧光标记检测细胞凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Cleaved-caspase3及LAMP1、LAMP2、LAMP2A、TFEB、mTOR等蛋白的表达。利用mTOR小分子抑制剂Rapamycin处理Sirt3敲减U87细胞,检测相关蛋白及细胞凋亡的变化。对Sirt3敲除前后的U87细胞进行核质分离实验,并检测p-TFEB蛋白表达的变化。在敲减及敲除Sirt3的U87细胞中分别过表达TFEB及Sirt3后,检测溶酶体膜蛋白表达的变化情况。结果Sirt3在高级别胶质瘤中高表达,且与患者的低生存率密切相关。敲减Sirt3表达后细胞凋亡增加(P<0.01),溶酶体膜蛋白LAMP1、LAMP2、LAMP2A显著下调(P<0.01),p-mTOR显著增加(P<0.01),通过核质分离实验发现敲除Sirt3后p-TFEB在胞质中增加(P<0.01)。在Sirt3敲除组过表达Sirt3后,LAMP1、LAMP2蛋白水平恢复,且溶酶体数量显著增加(P<0.01);在Sirt3敲减组过表达TFEB后,LAMPs蛋白表达明显上调(P<0.01)。结论Sirt3可能通过调控mTOR信号通路影响TFEB的核质分布,上调溶酶体膜蛋白LAMPs表达增强胶质瘤细胞溶酶体功能,进而促进胶质瘤细胞存活和恶性增殖,提示Sirt3可能是胶质瘤临床诊断和进展的分子标志物。 展开更多
关键词 沉默调节蛋白Sirt3 胶质瘤 凋亡 溶酶体 雷帕霉素靶蛋白 转录因子EB
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