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Med1对T细胞发育及CD4^(+)T细胞在免疫应答中分化的影响 被引量：1
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作者 郑会强 焦安君 +6 位作者 刘海艳 雷蕾 丁人一 封钊 张丹 张连军 张保军 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期1296-1303,共8页
目的:CD4^(+)T细胞在免疫应答过程中的分化受到由众多分子组成的复杂而精细的信号通路的调控,且调控T-bet表达的分子机制并未阐明。中介体复合物亚基1(mediator complex subunit 1,Med1)与多种辅助因子结合调节基因转录,促进细胞存活和... 目的:CD4^(+)T细胞在免疫应答过程中的分化受到由众多分子组成的复杂而精细的信号通路的调控,且调控T-bet表达的分子机制并未阐明。中介体复合物亚基1(mediator complex subunit 1,Med1)与多种辅助因子结合调节基因转录,促进细胞存活和增殖,影响恒定自然杀伤T细胞(invariant natural killer T cell,iNKT)的发育。本研究旨在探讨Med1对T细胞发育及CD4^(+)T细胞在免疫应答中分化的影响。方法:构建T细胞特异性敲除Med1基因(KO)小鼠(Med1F/FCD4cre^(+))并对其进行验证。采用流式细胞术检测KO组和对照(Con)组(Med1F/FCD4cre−)小鼠胸腺、脾和淋巴结中CD4^(+)和CD8^(+)T细胞的百分比及数目;用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)感染小鼠8 d后,检测小鼠脾中CD4^(+)T细胞及抗原特异性(GP66^(+))CD4^(+)T细胞的百分比及数目、Th1细胞(Ly6c^(+)PSGL1^(+))占CD4^(+)T细胞及抗原特异性CD4^(+)T细胞的百分比及数目、CD4^(+)T细胞及抗原特异性CD4^(+)T细胞中Tbet的荧光强度。结果:KO组与Con组小鼠胸腺中CD4^(+)和CD8^(+)T细胞的百分比及数目、脾和淋巴结中CD4^(+)T细胞的百分比及数目差异均无统计学意义(均P>0.05),但KO组脾和淋巴结中CD8^(+)T细胞的百分比及数目较Con组均显著降低(均P<0.05)。感染LCMV后,KO组与Con组小鼠脾中CD4^(+)T细胞及抗原特异性CD4^(+)T细胞的百分比及数目差异均无统计学意义(均P>0.05),但KO组Th1细胞占CD4^(+)T细胞及抗原特异性CD4^(+)T细胞的百分比及数目、CD4^(+)T细胞及抗原特异性CD4^(+)T细胞中T-bet的表达较Con组均显著降低(均P<0.05)。结论:T细胞中特异性敲除Med1基因不影响胸腺中CD4^(+)和CD8^(+)T细胞的发育,但是影响外周CD8^(+)T细胞的维持。在免疫应答中Med1基因缺失影响转录因子T-bet的表达,最终导致CD4^(+)T细胞向Th1细胞分化减少。 展开更多
关键词 中介体复合物亚基1 T细胞发育 免疫应答 TH1细胞 T-BET
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柴胡皂甙D诱导肝癌细胞同时发生凋亡及类凋亡性细胞死亡 被引量：13
2
作者 卢新兰 卢朝辉 +5 位作者 曹琰 张旭 王新 李雅睿 郭丹 和水祥 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期966-971,共6页
目的探讨柴胡皂甙D(saikosaponin-d,SSD)诱导人肝癌Hep3B细胞死亡的作用及其可能机制。方法将肝癌Hep3B细胞分为空白对照组、DMSO(溶媒)对照组和3个SSD(5、10、15μmol/L)处理组,MTT法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标记后采用流式... 目的探讨柴胡皂甙D(saikosaponin-d,SSD)诱导人肝癌Hep3B细胞死亡的作用及其可能机制。方法将肝癌Hep3B细胞分为空白对照组、DMSO(溶媒)对照组和3个SSD(5、10、15μmol/L)处理组,MTT法检测细胞活力;Annexin V-FITC/PI双标记后采用流式细胞仪定量检测死亡细胞的比例;Hoechst 33258染色后在形态学方面检测细胞凋亡;分光光度法检测半胱天冬酶-3(caspase-3)凋亡蛋白酶活性;倒置显微镜观察细胞形态改变;Western blotting和Real-time PCR技术分别用于检测CHOP(C/EBP homology protein)蛋白和mRNA表达。结果MTT结果显示,SSD浓度和时间依赖性抑制Hep3B细胞生长;流式细胞术结果表明SSD诱导Hep3B细胞死亡;Hoechst 33258染色后在荧光显微镜下观察,发现SSD处理组的细胞核出现凋亡细胞特征性的核染色体凝集、核固缩和碎裂;SSD可明显激活关键的凋亡执行分子caspase-3;通过倒置显微镜观察到SSD处理的细胞内出现大量空泡样改变——类凋亡的发生;总caspase抑制剂Z-VAD-FMK预处理能够有效抑制caspase-3活性,但仅能部分抑制SSD诱导的细胞死亡,且不能减少SSD诱导的细胞内空泡形成;SSD诱导应激诱导性分子CHOP蛋白和mRNA表达上调,该作用不能被Z-VAD-FMK抑制。结论SSD可诱导人肝癌Hep3B细胞同时发生caspase依赖性凋亡和非caspase依赖性类凋亡,其中CHOP表达升高可能是参与SSD诱导类凋亡的分子机制之一。 展开更多
关键词 柴胡皂甙D 细胞凋亡 类凋亡 肝癌 CHOP
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抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体的构建及评评价 被引量：2
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作者 王昊 杨一飞 +5 位作者 王炜 管冰 寻萌 张海 王字玲 赵勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第9期1149-1155,共7页
目的构建抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体,并验证其表达效率及功能。方法通过PCR方法将鱼精蛋白截短片段序列与抗黑色素瘤细胞表面抗原单链抗体基因相连接;采用TaKaRap MD19-T载体试剂盒将PCR后获得的融合蛋白扩增产物进行T载体... 目的构建抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体,并验证其表达效率及功能。方法通过PCR方法将鱼精蛋白截短片段序列与抗黑色素瘤细胞表面抗原单链抗体基因相连接;采用TaKaRap MD19-T载体试剂盒将PCR后获得的融合蛋白扩增产物进行T载体构建;构建GST融合蛋白表达载体以实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,经两步亲和纯化后获得scFv-tP蛋白;采用凝胶阻滞电泳迁移率变动分析EMSA技术检测Anti-MM scFv-tP与siRNA的结合活性;荧光分子标记scFv-tP蛋白后分别采用流式细胞术检测和共聚焦显微镜观察其与Li Br细胞株进行细胞表面抗原结合活性验证;采用不同浓度FITC标记的siRNA与scFv-tP进行混合,分别与LiBr细胞(A)及DU145细胞(B)进行混合孵育,观察肿瘤细胞对携载siRNA的单链抗体的内化活性。结果成功构建抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白片段融合蛋白(Anti-MM scFv-tP)表达载体;实现在大肠杆菌中该融合蛋白的可溶性表达,可获得较纯的scFv-tP蛋白;Anti-MM scFv-tP蛋白与siRNA有明显的结合与携载能力,可以有效与LiBr细胞表面特异性抗原进行结合,且有较强的内化活性。结论本研究构建的抗MM单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体可稳定表达,Anti-MM scFv-tP蛋白具有siRNA结合携载能力,可靶向识别结合进入LiBr细胞,为后续进一步研究该单链抗体融合蛋白靶向载体携载siRNA在体内外抑制恶性黑色素瘤恶性进展奠定坚实的基础。 展开更多
关键词 恶性黑色素瘤 单链抗体 表达载体 Anti-MM-scFv-tp
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RH株弓形虫颅内定位注射建立急性弓形虫脑炎小鼠模型的研究
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作者 司开卫 刘建新 +5 位作者 吴锋 李小其 付子豪 巩锦华 王军阳 程彦斌 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期746-754,共9页
目的观察RH株弓形虫定位感染小鼠海马引起的组织病变,以构建急性弓形虫脑炎小鼠模型。方法利用颅内定位注射技术,将定量(100、500、1000个)RH株弓形虫滋养体,定位注射入小鼠海马CA1区,观察小鼠的生存状况;Giemsa染色方法观察小鼠腹水和... 目的观察RH株弓形虫定位感染小鼠海马引起的组织病变,以构建急性弓形虫脑炎小鼠模型。方法利用颅内定位注射技术,将定量(100、500、1000个)RH株弓形虫滋养体,定位注射入小鼠海马CA1区,观察小鼠的生存状况;Giemsa染色方法观察小鼠腹水和脑组织匀浆中弓形虫数量的变化;尼氏染色和HE染色观察小鼠海马神经组织的病理改变;用免疫组化ABC法观察弓形虫在脑组织的分布。结果RH株弓形虫感染各组小鼠在感染第4天表现出明显的弓背、竖毛、腹胀、头颅细微震颤、偏瘫等症状。定量100感染组小鼠生存时间较长,腹水中未发现弓形虫滋养体,脑组织匀浆在96 h后发现少量的假包囊,小鼠死亡后则有较多滋养体;尼氏染色和HE染色则在144 h发现较多的组织坏死灶,CA1区神经细胞缺失;随感染时间的延长而脑组织损伤加重。而定量500感染组和定量1000感染组小鼠腹水和脑匀浆中均发现弓形虫滋养体;尼氏染色发现海马区神经元丢失和大量坏死;HE染色发现组织坏死灶及炎性细胞浸润,脑组织损伤均较定量100感染组小鼠显著加重;免疫组化证实坏死灶中有弓形虫的分布。结论定位感染RH株弓形虫100个滋养体小鼠存活时间较长,脑组织病理变化逐渐加重,损伤局限于脑组织内,小鼠表现典型的弓形虫脑炎症状。因此定位感染100个弓形虫滋养体可以构建急性弓形虫脑炎小鼠模型,可为弓形虫对脑神经的损伤机制研究奠定基础。 展开更多
关键词 弓形虫 颅内定位注射 海马 弓形虫脑炎
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盐酸青藤碱通过C/EBPβ-COX-2通路抑制LPA诱导的肝癌细胞增殖 被引量：6
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作者 王新 卢朝辉 +6 位作者 李雅睿 郭丹 张旭 曹琰 李皓瑞 和水祥 卢新兰 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2021年第5期786-789,共4页
目的观察溶血磷脂酸(LPA)对肝癌细胞CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)和环氧合酶-2(COX-2)表达及增殖的影响,并进一步探讨抗炎药物盐酸青藤碱(SIN)对其可能的作用。方法采用人肝癌Huh7细胞系,分别用Real-time PCR和Western blot检测基因... 目的观察溶血磷脂酸(LPA)对肝癌细胞CCAAT/增强子结合蛋白β(C/EBPβ)和环氧合酶-2(COX-2)表达及增殖的影响,并进一步探讨抗炎药物盐酸青藤碱(SIN)对其可能的作用。方法采用人肝癌Huh7细胞系,分别用Real-time PCR和Western blot检测基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法检测细胞增殖。结果用10μmol/L LPA处理Huh7细胞不同时间(0~6 h)后,C/EBPβ、COX-2的蛋白和mRNA表达水平呈时间依赖性升高;分别用不同浓度的LPA(0~10μmol/L)处理Huh7细胞6 h后,C/EBPβ、COX-2的蛋白和mRNA表达均呈浓度依赖性升高;SIN浓度依赖性抑制LPA所诱导的C/EBPβ、COX-2表达及细胞增殖。结论LPA通过诱导C/EBPβ-COX-2通路表达促进人肝癌Huh7细胞增殖,而SIN能够通过下调C/EBPβ-COX-2表达抑制LPA所诱导的细胞增殖。 展开更多
关键词 溶血磷脂酸 CCAAT/增强子结合蛋白β 环氧合酶-2 盐酸青藤碱 肝癌
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Arntl基因敲除对小鼠T细胞发育及抗感染功能的影响
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作者 孙亚娥 焦安君 +8 位作者 王昕 张星哲 雷蕾 杨小丰 解涛 周晓勃 史霖 张保军 刘晓斌 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期402-407,432,共7页
目的观察Arntl基因敲除对小鼠T细胞发育及抗感染功能的影响。方法构建在T细胞中特异性敲除Arntl基因小鼠(Arntl^(F/F)CD4cre^(+),KO);采用流式细胞术(FCM)检测KO小鼠胸腺和脾脏中T细胞各亚群的比例及数目;检测淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(... 目的观察Arntl基因敲除对小鼠T细胞发育及抗感染功能的影响。方法构建在T细胞中特异性敲除Arntl基因小鼠(Arntl^(F/F)CD4cre^(+),KO);采用流式细胞术(FCM)检测KO小鼠胸腺和脾脏中T细胞各亚群的比例及数目;检测淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)感染7 d后小鼠脾脏中T细胞各亚群比例、病毒特异性CD8^(+)T细胞的比例,以及CD8^(+)T细胞中IFN-γ的表达水平;qPCR方法检测小鼠脾脏中病毒载量;借助流式细胞仪分选初始CD4^(+)T细胞(CD4^(+)CD25^(-)CD44^(-)CD62L^(+)T细胞),经体外诱导Th1细胞分化,检测表达IFN-γ细胞的比例。结果与对照组(Arntl^(F/F)CD4cre^(-),WT)小鼠相比,KO小鼠胸腺和脾脏中T细胞各亚群的百分比及数目均无明显改变(P>0.05)。感染LCMV后,KO小鼠脾脏中效应T细胞的比例较对照组无明显改变(P>0.05),但分泌IFN-γT细胞的比例显著增多(P<0.05),病毒清除率升高(P<0.05)。此外,KO小鼠初始CD4^(+)T细胞向Th1细胞分化较对照组显著增强(P<0.05)。结论Arntl在T细胞中特异性敲除不影响T细胞的发育,但会增强T细胞抗病毒感染的能力。 展开更多
关键词 Arntl T细胞发育 病毒感染 免疫应答 辅助性(Th)T细胞分化
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利用CRISPR/Cas9核酸酶靶向细菌必需基因的特异性抗菌剂研究 被引量：1
7
作者 王令 任艳艳 +5 位作者 郭苗苗 王金萍 杜伟立 郭熠洁 路宏朝 张涛 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期1080-1089,共10页
CRISPR/Cas9核酸酶是一种高效和精确的基因组DNA编辑工具。目前,CRISPR/Cas9被开发成一种新型抗菌剂,通过靶向破坏目标基因,例如抗生素耐药基因来诱导细菌死亡。本研究利用CRISPR携带多靶点优势,同时靶向大肠杆菌必需基因gyrA、gyrB和fo... CRISPR/Cas9核酸酶是一种高效和精确的基因组DNA编辑工具。目前,CRISPR/Cas9被开发成一种新型抗菌剂,通过靶向破坏目标基因,例如抗生素耐药基因来诱导细菌死亡。本研究利用CRISPR携带多靶点优势,同时靶向大肠杆菌必需基因gyrA、gyrB和folA,以达到杀菌作用。本设计针对3个内源基因的CRISPR系列载体,分别含有1个、2个或3个靶点。当IPTG诱导Cas9表达后,CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA (trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA)复合物募集Cas9切割靶基因,导致细菌死亡。随着crRNA中靶点数量的增加,杀菌效率显著提高。当含有3个靶点的crRNA作用于细菌基因组时,杀菌效率达到99.35%。此外,在存活的大肠杆菌中,crRNA表达质粒的靶序列和直接重复序列发现碱基缺失,而内源靶基因和Cas9基因均未发生突变。最后,该CRISPR系统还应用于其他大肠杆菌实验室菌株和产肠毒素K88菌株,并表现出高效的杀菌作用。我们设计了一种基于CRISPR/Cas9核酸酶的新型抗菌剂,为抗菌剂的研发提供新策略。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 必需基因 抗菌剂 杀菌作用
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