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低氧环境对三阴性乳腺癌细胞糖代谢途径的重编程 被引量：1
1
作者 胡沥予 李航真 +3 位作者 方天星 戴雯 李翔 曾凡才 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第7期936-948,共13页
代谢改变是癌细胞的特征之一。研究表明,低氧会使癌细胞的糖代谢发生改变,但是更详细的分子机制仍有待进一步研究。本研究利用转录物组测序技术(RNA-sequencing,RNA-seq)和生物信息学分析发现,低氧导致BT549细胞中334个基因和MDA-MB-23... 代谢改变是癌细胞的特征之一。研究表明,低氧会使癌细胞的糖代谢发生改变,但是更详细的分子机制仍有待进一步研究。本研究利用转录物组测序技术(RNA-sequencing,RNA-seq)和生物信息学分析发现,低氧导致BT549细胞中334个基因和MDA-MB-231细胞中215个基因在转录水平的表达改变。这些表达变化的基因多与糖代谢相关。进一步分析RNA-seq数据并应用Western印迹、酶活性检测和代谢产物定量测定的结果显示,低氧通过升高BT549细胞中葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)和MDA-MB-231细胞中GLUT1和GLUT3的表达以增加葡萄糖的摄入;低氧使催化糖的无氧氧化途径几乎全部反应的酶都至少有一种同工酶或酶蛋白亚基,以及调节酶6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)和4(PFKFB4)同工酶的表达增加来促进了糖的无氧氧化;低氧还通过增加调节丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)和3(PDK3)同工酶基因的表达,以及降低关键酶异柠檬酸脱氢酶3(IDH3)同工酶、琥珀酸脱氢酶B亚基和D亚基的表达来减少糖的有氧氧化途径进行;低氧可能还增加磷酸戊糖途径的关键酶葡糖-6-磷酸脱氢酶、糖原合成途径的关键酶糖原合酶GYS1同工酶的表达以促进这2条途径的进行,而对糖异生和糖原分解代谢途径酶基因的表达影响较小。生物信息学分析乳腺癌组织样本在线数据库中糖代谢途径酶基因在转录水平表达结果与细胞研究结果基本一致。总之,该文系统分析了低氧对糖代谢6条代谢途径中全部酶以及2种重要调节酶的影响,可见低氧会通过改变这些酶的同工酶或亚基的基因表达使糖代谢途径进行重编程,这对进一步认识低氧环境下癌细胞糖代谢的分子机制具有一定的意义。 展开更多
关键词 三阴性乳腺癌 低氧 糖代谢途径 酶基因表达 代谢重编程
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应用CRISPR技术敲除MDA-MB-231细胞系的NODAL基因的研究
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作者 李念峰 方天星 +1 位作者 倪玉芳 曾凡才 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期240-250,共11页
NODAL(Nodal growth differentiation factor)是一种细胞因子,为研究其功能,需建立敲除NODAL基因的细胞系。构建了两种作用于不同靶位点的CRISPR/Cas9表达载体和一种打靶载体,并通过电转法导入三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经嘌呤霉素... NODAL(Nodal growth differentiation factor)是一种细胞因子,为研究其功能,需建立敲除NODAL基因的细胞系。构建了两种作用于不同靶位点的CRISPR/Cas9表达载体和一种打靶载体,并通过电转法导入三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231,经嘌呤霉素抗性筛选和挑单细胞克隆,再应用PCR和测序技术鉴定基因型,以及Western Blot检测蛋白表达。将等位基因同源重组鉴定为阳性的8个单细胞克隆再经非同源重组和大片段缺失基因型鉴定,仅一个单细胞克隆的靶位点发生移码突变,4个单细胞克隆的靶位点有大片段缺失发生,4个单细胞克隆的靶位点检测到野生型等位基因。蛋白表达检测结果显示,仅有2个单细胞克隆未检测到NODAL蛋白表达,3个单细胞克隆的NODAL蛋白表达降低,另外3个单细胞克隆的NODAL蛋白表达无明显变化。最终获得了基因型和蛋白表达鉴定为敲除NODAL基因的单细胞克隆,为进一步研究NODAL在乳腺癌细胞中的分子机制奠定了基础。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 乳腺癌 基因敲除 NODAL基因
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黄胸鼠Ldha基因的克隆、原核表达及酶学性质研究
3
作者 倪玉芳 张树军 +3 位作者 方天星 万军 陈洁 曾凡才 《四川动物》 北大核心 2021年第6期601-610,共10页
Ldha基因表达可生成参与糖代谢的乳酸脱氢酶(LDH),通过克隆黄胸鼠Rattus tanezumi的Ldha基因并进行原核表达后可以研究其酶学性质。以黄胸鼠骨骼肌cDNA为模板,通过RT-PCR技术获得黄胸鼠Ldha基因编码序列,进行生物信息学分析后构建pET28... Ldha基因表达可生成参与糖代谢的乳酸脱氢酶(LDH),通过克隆黄胸鼠Rattus tanezumi的Ldha基因并进行原核表达后可以研究其酶学性质。以黄胸鼠骨骼肌cDNA为模板,通过RT-PCR技术获得黄胸鼠Ldha基因编码序列,进行生物信息学分析后构建pET28α-Ldha重组表达质粒,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达,采用SDS-PAGE和Western Blot对表达蛋白进行鉴定,最后检测表达蛋白的酶学性质。结果显示,黄胸鼠Ldha基因编码区序列被成功克隆,纯化后的原核表达蛋白分子量约为37 kD,Western Blot证实后,分别以丙酮酸和乳酸为底物测得酶的平均比活性为113.760 U·mg^(-1)±1.463 U·mg^(-1)和2.180 U·mg^(-1)±0.125 U·mg^(-1),琼脂糖凝胶电泳同工酶谱分析显示该蛋白具有LDH活性且仅形成1条同工酶带。在pH7.0,25℃条件下,LDHA蛋白对丙酮酸、NADH、乳酸、NAD+4种底物的平均Km值分别为0.170 mmol·L^(-1)±0.193 mmol·L^(-1)、0.088 mmol·L^(-1)±0.008 mmol·L^(-1)、22.540 mmol·L^(-1)±0.007 mmol·L^(-1)、0.413 mmol·L^(-1)±0.069 mmol·L^(-1)。黄胸鼠Ldha基因编码序列被首次克隆并表达出具有活性的酶蛋白,分析了其酶学性质,可为后续研究啮齿类动物LDH的结构和功能提供基础资料。 展开更多
关键词 黄胸鼠 Ldha基因 原核表达 蛋白纯化 酶学性质
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