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HEK293细胞悬浮培养技术及其应用研究进展
1
作者 岳欣豫 吉雯娜 +7 位作者 周锦鱼 靳莉武 杨迪 刘振斌 孙娜 乔自林 马忠仁 王家敏 《生物技术通报》 北大核心 2025年第8期82-91,共10页
生物制药产品的生产主要依赖于哺乳动物细胞,尤其是在制造复杂的蛋白质药物,因为其能够进行复杂的翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs),对于蛋白质的功能和稳定性至关重要,一些生物制药商品如重组治疗蛋白、疫苗、抗癌... 生物制药产品的生产主要依赖于哺乳动物细胞,尤其是在制造复杂的蛋白质药物,因为其能够进行复杂的翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs),对于蛋白质的功能和稳定性至关重要,一些生物制药商品如重组治疗蛋白、疫苗、抗癌药物和其他临床相关药物等大多数都是利用了哺乳动物细胞平台生产。HEK293细胞(human embryonic kidney 293 cells)是所有人类细胞系中最常用的宿主细胞之一,但由于贴壁细胞在生产应用中的高投资成本,以及血清添加有可能携带的外源风险等问题,导致其最初在生产应用方面受到限制,而HEK293悬浮细胞相比于贴壁细胞更具优势,其不仅生产成本大大降低,没有血清的添加更增加了生产生物制品的安全性。目前,HEK293悬浮细胞已广泛应用于多个领域,并已成为生产蛋白质、疫苗和基因治疗药物的强大载体和新平台。本文综述了HEK293细胞的来源及其衍生细胞系,总结目前贴壁细胞的悬浮驯化技术以及用于HEK293细胞的无血清培养基,并描述目前HEK293细胞在疫苗生产、基因治疗药物生产以及实验室基础研究方面的应用进展,讨论了HEK293细胞大规模生产的意义及存在的问题,最后对未来HEK293细胞的研究方向以及大规模生产的应用前景进行展望。 展开更多
关键词 HEK293细胞 悬浮驯化 生物制药
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动物细胞永生化研究进展 被引量：2
2
作者 张震宇 靳莉武 +4 位作者 王婧尊 田玲 乔自林 杨迪 阿依木古丽·阿不都热依木 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期78-89,共12页
细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不... 细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难,肿瘤风险以及动物福利伦理等原因,还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源,还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述,为未来的生物医学研究和应用提供参考。 展开更多
关键词 动物细胞 细胞永生化 永生化机制 永生化方法
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动物细胞生物反应器研究进展 被引量：3
3
作者 李自良 赵彩红 +3 位作者 王美皓 王家敏 乔自林 李倬 《动物医学进展》 北大核心 2020年第6期103-108,共6页
细胞基质生物制品大规模生产工艺的选择首要考虑因素是该产品工艺所涉及的生物反应器系统。论文针对动物细胞培养的基本特点,就不同动物细胞生物反应器的结构和原理、优点与缺点、结构优化、传感器最新进展等进行了综述,其目的在于为生... 细胞基质生物制品大规模生产工艺的选择首要考虑因素是该产品工艺所涉及的生物反应器系统。论文针对动物细胞培养的基本特点,就不同动物细胞生物反应器的结构和原理、优点与缺点、结构优化、传感器最新进展等进行了综述,其目的在于为生物制品研发和生产实际应用中选择更加适合培养工艺的生物反应器,提高动物细胞大规模培养生产生物制品的效率,也为促进新型生物反应器的研究与开发提供一定的参考。 展开更多
关键词 动物细胞 生物反应器 生物制品
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MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感疫苗研究与生产中的应用进展 被引量：2
4
作者 靳莉武 张震宇 +4 位作者 靳冬武 马花 马玉梅 乔自林 王家敏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期38-47,共10页
流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒... 流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术。通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性。总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具。同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性。 展开更多
关键词 MDCK细胞 细胞悬浮驯化 无血清培养基 流感疫苗 安全性
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杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)表达的动物病毒样颗粒及疫苗研究进展 被引量：1
5
作者 王炎 高婉宁 +3 位作者 范益阳 玉妹 张德荣 柏家林 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第1期203-208,共6页
杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自... 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自组装形成的纳米颗粒,由于缺乏病毒遗传物质,其安全性较高。VLP表面抗原排列高度有序,可有效诱导免疫反应,是一种新型的亚单位疫苗。本文综述了IBEVS在动物VLP疫苗中的应用现状,分析了当前IBEVS存在的问题及其解决策略,为动物VLP疫苗的进一步开发提供参考。 展开更多
关键词 病毒样颗粒 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS) 动物病毒样颗粒疫苗
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动物细胞低氧培养相关调控因子研究进展 被引量：1
6
作者 张兰 姚一凡 +3 位作者 陈树吾 马芳芳 许瑾 杨琨 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第5期1926-1933,共8页
近年来低氧细胞培养逐渐成为研究热点,低氧条件下可提高细胞体外扩增的生长动力学、细胞的增殖率及干细胞分化等功能。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是应答低氧应激的关键因子,也是介导低氧信号的转导中枢,... 近年来低氧细胞培养逐渐成为研究热点,低氧条件下可提高细胞体外扩增的生长动力学、细胞的增殖率及干细胞分化等功能。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)是应答低氧应激的关键因子,也是介导低氧信号的转导中枢,与其相关的血管内皮生长因(vascular endothelia growthfactor,VEGF)、低氧促有丝分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor,HIMF)及促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等是其重要的靶基因,它们之间的相互作用对低氧条件下细胞的发生、发展有重要作用。笔者对低氧培养细胞的研究现状及低氧相关细胞因子的调控机制及作用进行概述,以期为探索细胞低氧机理提供理论依据,为低氧适应性及高原疾病治疗提供更多的研究思路。 展开更多
关键词 低氧培养细胞 低氧相关因子 调控机制
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牛乳铁蛋白对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎影响的研究
7
作者 陈遥 赵钰 +3 位作者 刘春 舒星富 张海霞 马忠仁 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第3期286-295,共10页
为研究牛乳铁蛋白(bLF)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响,本研究将40只健康昆明小鼠分为4组,分别为阴性对照组(NC组,实验1 d~7 d小鼠灌服生理盐水,0.3 mL/d)、DSS组(在NC组的基础上,在实验8 d~14 d小鼠灌肠4%DSS,0.3 mL... 为研究牛乳铁蛋白(bLF)对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的影响,本研究将40只健康昆明小鼠分为4组,分别为阴性对照组(NC组,实验1 d~7 d小鼠灌服生理盐水,0.3 mL/d)、DSS组(在NC组的基础上,在实验8 d~14 d小鼠灌肠4%DSS,0.3 mL/d)、bLF组(实验1 d~7 d小鼠灌服5 mg/mL bLF,0.3 mL/d),及DSS+bLF组(在bLF组的基础上,其余操作同DSS组)。通过统计各组小鼠体质量下降率、粪便黏度和便血的总评分计算各组小鼠的疾病活动指数(DAI)。在实验第15 d剖杀各组小鼠,测量并观察各组小鼠的结肠长度和脾脏形态;计算各脏器指数;制备各组小鼠结肠病理切片观察结肠的病变并评分;同时经PAS染色后利用Image J软件统计各组小鼠结肠杯状细胞的数量;采用试剂盒检测各组小鼠结肠中丙二醛(MDA)和髓过氧化物酶(MPO)的含量;采用RT-qPCR检测各组小鼠结肠中4种细胞因子的相对转录水平。DAI结果显示,与NC组和DSS组相比,bLF组小鼠的DAI为0;DSS组和DSS+bLF组小鼠的DAI均极显著升高,但均低于DSS组。结肠与脾脏形态显示,与NC组相比,DSS组小鼠结肠极显著缩短,脾脏明显肿胀,脾脏指数极显著升高;bLF组小鼠结肠长度、脾脏及脾脏指数均无明显变化;DSS+bLF组小鼠结肠长度有所恢复但仍显著缩短,脾脏轻微肿胀,脾脏指数无明显变化;与DSS组相比,bLF组和DSS+bLF组小鼠结肠均极显著增长,脾脏无明显变化或轻微肿胀,脾脏指数均极显著下降。脏器指数结果显示,与NC组相比,bLF组小鼠各脏器指数均无显著差异,DSS+bLF组小鼠除肺脏指数显著升高其余各脏器指数均无显著差异;与DSS组相比,bLF组小鼠除肾脏指数显著下降其余各脏器指数均无显著差异,DSS+bLF组小鼠除心脏指数显著下降外其余各脏器指数均无显著差异。病变观察结果显示,DSS组小鼠结肠组织出现严重病变,NC组和bLF组小鼠结肠组织均无明显病变,DSS+bLF组小鼠结肠组织病变较轻。其余结果显示,与NC相比,DSS组小鼠结肠组织评分、MDA及MPO含量,TNF-α、IL-6和IL-1β的转录水平均极显著和显著升高,杯状细胞数量、IL-10的转录水平均极显著降低;bLF组小鼠结肠组织评分、杯状细胞数量、MDA及MPO含量、上述3种细胞因子的转录水平均无显著变化,IL-10的转录水平极显著降低;DSS+bLF组小鼠结肠组织评分极显著升高,杯状细胞数量极显著减少,MDA及MPO含量均无显著变化,上述3种细胞因子的转录水平显著升高,IL-10的转录水平显著降低。与DSS组相比,bLF组和DSS+bLF组小鼠结肠组织评分极显著和显著降低,杯状细胞的数量均极显著增加,MDA及MPO含量极显著和显著降低,上述3种细胞因子的转录水平均显著降低,IL-10的相对转录水平极显著升高。上述结果表明,bLF能在一定程度上恢复DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠的缩短,缓解其结肠黏膜损伤、氧化应激及小鼠的炎症反应,维持小鼠的免疫稳态。本研究为bLF应用于炎症性疾病的治疗提供参考和新的思路。 展开更多
关键词 牛乳铁蛋白 溃疡性结肠炎 细胞炎症反应 葡聚糖硫酸钠
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病毒样颗粒在肿瘤治疗中的应用研究进展及展望
8
作者 刘春 陈国心 +3 位作者 李梦甜 赵钰 马忠仁 张海霞 《中国癌症杂志》 北大核心 2025年第6期585-591,共7页
病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)是由一种或几种病毒结构蛋白组合而成的中空纳米颗粒,其形态结构与天然病毒极其相似,但不包含任何遗传物质。因VLP具有良好的天然免疫原性和安全性,故常被用于肿瘤疫苗的开发。此外,与传统的药物递... 病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)是由一种或几种病毒结构蛋白组合而成的中空纳米颗粒,其形态结构与天然病毒极其相似,但不包含任何遗传物质。因VLP具有良好的天然免疫原性和安全性,故常被用于肿瘤疫苗的开发。此外,与传统的药物递送载体相比,VLP具有较好的生物相容性,且靶向性强,使得VLP在递送抗肿瘤药物方面备受关注。近年来利用VLP高效递送基因编辑工具,为肿瘤治疗提供了新的可能。VLP可以通过多种机制来抑制肿瘤生长和转移,如VLP可通过激活免疫应答来抑制肿瘤的生长,通过激发机体的免疫系统,促进肿瘤相关抗原的表达,从而增强机体对肿瘤细胞的识别和清除能力等。本文介绍基于不同病毒来源的VLP在预防性或治疗性疫苗以及药物递送载体方面的应用研究进展,并探讨新的开发策略。这些研究不仅可拓宽VLP在抗肿瘤领域的应用范围,也将为未来的研究与应用展现更广阔的前景。 展开更多
关键词 病毒样颗粒 药物递送载体 抗肿瘤药物 肿瘤疫苗
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A型流感病毒NP蛋白与TRIM25蛋白互作的研究
9
作者 胡欣妍 刘倩芸 +2 位作者 安乐乐 蓝秋菊 马晓霞 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第3期219-226,共8页
目的探索A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)核蛋白(nucleoprotein,NP)与TRIM25之间的互作关系。方法运用生物信息学的方法对IAV NP蛋白的理化特性及蛋白质结构进行分析;利用分子对接技术模拟IAV NP和TRIM25蛋白之间的互作情况并预测... 目的探索A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)核蛋白(nucleoprotein,NP)与TRIM25之间的互作关系。方法运用生物信息学的方法对IAV NP蛋白的理化特性及蛋白质结构进行分析;利用分子对接技术模拟IAV NP和TRIM25蛋白之间的互作情况并预测其互作位点;以A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)PR8毒株基因组cDNA为模板,PCR扩增NP蛋白克隆至真核表达载体pCMV-C-Flag上,构建真核表达重组质粒pCMV-Flag-NP,并进一步验证其表达,同时检测重组质粒pCMV-Flag-NP及pCMV-HA-TRIM25在不同时段蛋白表达的水平;利用免疫共沉淀技术对NP蛋白和TRIM25蛋白进行互作验证;使用激光共聚焦显微镜对NP蛋白与TRIM25蛋白在细胞中的共定位情况进行观察。结果生物信息学分析发现NP蛋白由498个氨基酸、20种氨基酸构成,为不稳定的亲水蛋白。NP蛋白存在N-糖基化位点和O-糖基化位点,并且存在多个磷酸化位点,但并不存在跨膜结构域及信号肽结构域。NP蛋白二级结构中α-螺旋和无规则卷曲结构占比较高。分子对接技术预测结果显示IAV NP与TRIM25蛋白之间存在相互作用且具有多个潜在互作位点,其中包括NP蛋白第233位丙氨酸、第234位丙氨酸、第236位赖氨酸、第440位丙氨酸等多个位点。成功构建并表达IAV NP蛋白,通过免疫共沉淀和激光共聚焦显微镜观察验证IAV NP与TRIM25蛋白之间存在互作关系。结论IAV NP蛋白的结构与其所发挥的功能息息相关,其对于病毒自身的重要性不言而喻。同时IAV NP与TRIM25蛋白之间存在互作关系,这可能与TRIM25抗流感病毒机制相关,后续的深入研究或许能为抗流感病毒策略提供新思路。 展开更多
关键词 A型流感病毒 核蛋白 TRIM25 蛋白互作
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西北部分地区密点麻蜥线粒体ND2和ND4基因遗传多样性分析
10
作者 陈博昊 杨启元 +3 位作者 张俊哲 黄增妹 庞振琨 李铀 《现代农业科技》 2025年第11期164-169,共6页
利用线粒体ND2、ND4基因部分序列,分析了西北2个自治区(宁夏、内蒙古)部分地区的密点麻蜥遗传多样性。结果表明,2个线粒体基因的密点麻蜥样本均表现为高单倍型多样性(>0.5)和高核苷酸多样性(>0.005),说明该群体遗传多样性水平较高... 利用线粒体ND2、ND4基因部分序列,分析了西北2个自治区(宁夏、内蒙古)部分地区的密点麻蜥遗传多样性。结果表明,2个线粒体基因的密点麻蜥样本均表现为高单倍型多样性(>0.5)和高核苷酸多样性(>0.005),说明该群体遗传多样性水平较高,遗传结构较为稳定;系统发育分析显示,密点麻蜥种群间存在基因流,且与其他麻蜥间存在亲缘关系。研究结果丰富了西北地区密点麻蜥遗传资源数据,可以为西北地区密点麻蜥遗传资源保护和利用提供参考。 展开更多
关键词 密点麻蜥 遗传多样性 线粒体DNA ND2基因 ND4基因 西北地区
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生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化 被引量：4
11
作者 王家敏 李自良 +5 位作者 马芳芳 康碧静 田玲 李倬 马忠仁 乔自林 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期3936-3947,共12页
旨在筛选伪狂犬病病毒(PRV)敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID... 旨在筛选伪狂犬病病毒(PRV)敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID_(50)病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速120 r·min^(-1)、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达(7.61±0.18)×10~6 cells·mL^(-1)、细胞活率为(96.93±1.18)%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10~6cells·mL^(-1)、搅拌转速80 r·min^(-1),5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值(7.13±0.11)lgTCID_(50)·mL^(-1)。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。 展开更多
关键词 BHK-21悬浮细胞 生物反应器 伪狂犬病病毒 敏感性
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不同类型牛血清对MDCK细胞培养效果研究 被引量：10
12
作者 李自良 王家敏 +4 位作者 赵彩红 王美皓 李倬 乔自林 马忠仁 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第4期21-25,共5页
为建立贴壁培养型细胞最适血清的快速筛选方法,在含10%不同类型牛血清的DMEM培养液中连续传代培养MDCK细胞,分别用传代稳定性观察、绘制生长曲线、分析生长动力学与贴壁率的方法评价不同类型牛血清对MDCK贴壁细胞促生长效果的影响,并进... 为建立贴壁培养型细胞最适血清的快速筛选方法,在含10%不同类型牛血清的DMEM培养液中连续传代培养MDCK细胞,分别用传代稳定性观察、绘制生长曲线、分析生长动力学与贴壁率的方法评价不同类型牛血清对MDCK贴壁细胞促生长效果的影响,并进一步在细胞工厂中扩大培养验证。结果显示,3种类型血清均能较好促进细胞的生长增殖且细胞生长曲线均呈"S"型;MDCK细胞生长动力学分析发现3种类型血清平均比生长速率差异不显著(P>0.05);最大增殖密度和倍增时间胎牛血清均优于新生牛血清;平均集落形成率分析发现,进口胎牛血清略高于国产胎牛血清(P=0.02)、国产新生牛血清低于国产和进口胎牛血清差异极显著(P<0.0001)。国产新生牛血清在1层和10层细胞工厂中连续传代培养MDCK细胞,细胞生长良好,传代过程中细胞生长稳定。通过研究不同类型的牛血清对MDCK细胞培养效果的影响,为疫苗生产中MDCK细胞扩大培养和短时间内成功筛选出培养MDCK细胞的最佳血清提供一定的科学依据。 展开更多
关键词 MDCK细胞 牛血清 贴壁培养 生长曲线 贴壁率
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昆虫细胞无血清培养基的研究
13
作者 王家敏 马桂兰 +4 位作者 冯玉萍 马伟 马祺 马忠仁 乔自林 《甘肃畜牧兽医》 2019年第11期44-46,共3页
为开发昆虫细胞无血清悬浮培养基,以基础培养基Grace’s Insect medium为基础,添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉和PF-68等组份后,分别接种Sf-21、Hi-five两种昆虫细胞进行无血清悬浮培养。结果显示:两株昆虫细胞生长均较好,均能够很好的... 为开发昆虫细胞无血清悬浮培养基,以基础培养基Grace’s Insect medium为基础,添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉和PF-68等组份后,分别接种Sf-21、Hi-five两种昆虫细胞进行无血清悬浮培养。结果显示:两株昆虫细胞生长均较好,均能够很好的全悬浮生长,Sf-21细胞最高密度可达(39.8±2.6)×105/ml,Hifive细胞最高密度可达(44.4±1.0)×105/ml。本研究为昆虫细胞培养提供一种无血清悬浮培养基配方,为我国利用昆虫细胞杆状病毒表达系统生产生物制品提供基础保障。 展开更多
关键词 昆虫细胞 无血清培养基 悬浮培养 生长曲线
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MDCK悬浮细胞制备及流感病毒敏感性研究 被引量：5
14
作者 李自良 王家敏 +7 位作者 赵彩红 王美皓 李莉 张雪梅 李倬 靳冬武 马忠仁 乔自林 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期981-988,共8页
目的建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性。方法运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定... 目的建立无血清悬浮培养MDCK细胞的方法,分析其传代、线性放大过程中的稳定性及增殖流感病毒的敏感性。方法运用逐步降血清悬浮驯化法将贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞;进一步分析其生长动力学特性、连续传代稳定性,在5L生物反应器中扩大培养;接种流感和禽流感病毒,测定不同时间HA效价、CCID50滴度,分析其病毒敏感性。结果成功将ATCC引进的贴壁培养型MDCK细胞驯化为无血清全悬浮培养型MDCK细胞(命名为MDCK-XF02细胞)并冻存;不同接种密度培养MDCK-XF02细胞最大增殖密度均达13.0×10^6 cells/mL以上,且差异无统计学意义(P>0.05);连续传代培养过程中细胞形态和生长状况稳定,比生长速率差异无统计学意义(P>0.05);三个代次的MDCK-XF02细胞以2.0×10^6 cells/mL接种于5 L生物反应器,细胞生长状态良好,倍增时间小于21 h,在批培养中细胞浓度高达(14.57±0.47)×10^6 cells/mL,比生长速率分别为(0.027±0.012)h^-1、(0.028±0.013)h^-1、(0.027±0.013)h^-1(P>0.05);接种甲型流感病毒H1N1和H3N2,HA效价达到(6~7)log2HA/25μL、CCID50为(4.35~4.68)lgCCID50/mL;接种乙型流感病毒B/P和BX-35增殖效果更好,HA效价达到(9~10)log2HA/25μL,CCID50为(6.38~7.31)lgCCID50/mL。接种重组禽流感病毒H5亚型Re-5、Re-6、Re-10均能很好的增殖,HA效价达到(7~9)log2HA/25μL、CCID50为(6.21~6.96)lgCCID50/mL。结论本研究获得一株具有自主知识产权的流感/禽流感病毒敏感的无血清悬浮培养型MDCK-XF02细胞株,实现了生物反应器高密度放大培养,为我国开展流感疫苗研究和生产提供细胞基质,也为其他动物细胞悬浮驯化提供参考。 展开更多
关键词 MDCK细胞 无血清 悬浮驯化 流感病毒 禽流感病毒
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稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞的建立及其对凋亡和细胞周期的影响
15
作者 杨迪 黄玲巍 +2 位作者 杨雅雯 乔自林 王家敏 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期223-230,共8页
表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞... 表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中,48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中,经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率,RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达,建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体,由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系,PCR产物交换入线性化表达载体,获得了阳性转化子8个,大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为3.5×10^(8 )TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著,经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示,EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升,且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株,犬EGFR的过表达催化了细胞分裂,使DNA复制加快,同时刺激了细胞凋亡。 展开更多
关键词 犬肾细胞系 表皮生长因子受体 慢病毒载体
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Vero细胞基质流感疫苗研究进展 被引量：2
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作者 马芳芳 康碧静 +6 位作者 马春英 刘振斌 杨迪 乔自林 王明明 马忠仁 王家敏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期137-143,共7页
流感防控是人类至今面临的严峻挑战之一,流感疫苗接种是预防流感的关键。由于传统的流感疫苗生产工艺依赖鸡胚生产而存在局限性,规模化流感疫苗生产基质逐渐从鸡胚转为哺乳动物细胞,目前用于流感疫苗研发的常见细胞系有MDCK、Vero和PER... 流感防控是人类至今面临的严峻挑战之一,流感疫苗接种是预防流感的关键。由于传统的流感疫苗生产工艺依赖鸡胚生产而存在局限性,规模化流感疫苗生产基质逐渐从鸡胚转为哺乳动物细胞,目前用于流感疫苗研发的常见细胞系有MDCK、Vero和PER.C6。其中Vero细胞低代次无成瘤性且已用于多种人用病毒性疫苗生产,是WHO推荐的广泛用于人和动物病毒性疫苗生产的首选细胞系,但Vero细胞基质流感疫苗在生产中仍面临挑战。现就流感疫苗研究、细胞基质流感疫苗的综合比较及Vero细胞在流感疫苗生产中所面临的困难予以综述,旨在为细胞基质流感疫苗研发提供参考。 展开更多
关键词 流感 VERO细胞 疫苗 悬浮培养
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低氧下牦牛、黑白花牛肾间质成纤维细胞PDK1、Smad2、Caspase3等因子表达差异研究 被引量：2
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作者 姚一凡 张伊阳 +5 位作者 董仕慧 李睿 张兰 周熳琳 乔自林 杨琨 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1335-1343,共9页
为了比较低氧条件下不同海拔牛种肾间质成纤维细胞(RIFs)内PDK1、Smad2、Caspase3等因子的表达差异及细胞增殖差异,并进一步探究牦牛肾脏的高原低氧适应性特点,本研究采用牦牛和黑白花牛RIFs作为研究对象,低氧(1%O2)处理后,通过实时荧... 为了比较低氧条件下不同海拔牛种肾间质成纤维细胞(RIFs)内PDK1、Smad2、Caspase3等因子的表达差异及细胞增殖差异,并进一步探究牦牛肾脏的高原低氧适应性特点,本研究采用牦牛和黑白花牛RIFs作为研究对象,低氧(1%O2)处理后,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB)法检测细胞内PDK1等因子表达差异。波形蛋白(Vimentin)免疫组化染色鉴定结果显示,两种牛的原代RIFs纯度较高,可用于后续试验。低氧处理后,两种牛的RIFs内PDK1、Smad2及Caspase3的mRNA和蛋白表达均存在不同程度上调,且种属间存在显著差异(P<0.05),牦牛HIF-1α、PDK1、Smad2及Caspase3等基因表达量于24 h达到峰值,之后下调,而黑白花牛基因则随时间呈递增趋势,且牦牛RIFs低氧下增殖能力低于黑白花牛。综上所述,低氧诱导的相关转录因子表达存在差异,两种牛RIFs的增殖能力存在差异,这可能是导致低氧下黑白花牛肾纤维化程度的加深,从而产生肾源性高原疾病的原因之一。本研究为比较不同海拔牛种肾脏的低氧适应性研究提供了基础数据,为探索牦牛肾脏高原低氧适应机制提供了一定的理论依据。 展开更多
关键词 牦牛 黑白花牛 肾间质成纤维细胞 低氧 增殖
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Marc-145细胞低血清适应培养传代稳定性和无血清驯化研究 被引量：6
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作者 阿尔祖古丽·阿依丁 卢美琳 +3 位作者 李自良 贺丹 乔自林 阿依木古丽·阿不都热依木 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第3期415-420,共6页
通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、... 通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、P20、P30、P40和P50代细胞的形态、倍增时间、生长曲线、染色体和对蓝耳病病毒敏感性等特性进行对比分析。研究发现,传代过程中Marc-145细胞均呈扁平多边形上皮样生长,P10代细胞倍增时间为34.15 h,P50代细胞倍增时间为36.16 h,P50代细胞倍增时间稍有延长但差异不显著。P10、P20、P30、P40和P50代的Marc-145细胞生长曲线均呈“S”形;P10代和P50代细胞染色体众数都集中在88~90条。接种病毒后,P10、P20、P30、P40和P50细胞TCID 50间无显著差异,表明细胞传50代后,细胞特性没有发生明显变化。P50细胞进行无血清悬浮培养48 h后,细胞密度可达到4.14×106 mL-1。 展开更多
关键词 MARC-145细胞 无血清驯化 悬浮培养
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生物反应器培养工艺的狂犬病毒疫苗研究进展 被引量：5
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作者 刘文凯 王家敏 乔自林 《甘肃畜牧兽医》 2020年第10期9-11,共3页
狂犬病是一种由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)感染引起的对人畜危害极大的传染病,安全有效的人用和兽用狂犬疫苗是预防狂犬病的最重要手段。生物反应器因自动化程度高和生产效率高而成为当前狂犬疫苗生产的最主要工艺,本文对利用生物反... 狂犬病是一种由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)感染引起的对人畜危害极大的传染病,安全有效的人用和兽用狂犬疫苗是预防狂犬病的最重要手段。生物反应器因自动化程度高和生产效率高而成为当前狂犬疫苗生产的最主要工艺,本文对利用生物反应器生产狂犬病毒疫苗工艺的进展进行了总结。 展开更多
关键词 狂犬疫苗 生物反应器 培养工艺
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不同批次新生牛血清对MDCK细胞培养效果的研究 被引量：1
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作者 康碧静 马芳芳 +3 位作者 马春英 马忠仁 乔自林 王家敏 《福建畜牧兽医》 2023年第1期1-5,共5页
为筛选适宜MDCK细胞生长的最佳血清,分析6个批次新生牛血清在两种培养方式即贴壁静置培养条件下MDCK细胞的生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养条件下MDCK细胞的生长状态、生长速率、生长动力学情况。结果表明6组新生牛血清贴壁... 为筛选适宜MDCK细胞生长的最佳血清,分析6个批次新生牛血清在两种培养方式即贴壁静置培养条件下MDCK细胞的生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养条件下MDCK细胞的生长状态、生长速率、生长动力学情况。结果表明6组新生牛血清贴壁静置培养的MDCK细胞,平均集落形成率最大的为第Ⅴ组,最小的为第Ⅰ组,由大到小依次为第Ⅴ、Ⅵ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组;微载体悬浮培养条件下的MDCK细胞,最大增殖密度从大到小依次为第Ⅳ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅴ、Ⅱ、Ⅰ组,平均倍增时间由大到小依次为第Ⅵ、Ⅴ、Ⅲ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅰ组。因此,通过对不同批次血清贴壁静置培养的MDCK细胞生长状态、平均集落形成率及微载体悬浮培养的MDCK细胞生长状态、生长动力学评价,筛选出适宜细胞生长的新生牛血清批次为第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组,而第Ⅰ组新生牛血清对细胞生长的促进效果不明显,细胞生长状态不佳。 展开更多
关键词 新生牛血清 MDCK细胞 生长曲线
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