山羊毛囊干细胞分离培养方法研究 被引量：16

1

作者 史明艳 杨学义 窦忠英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期436-440,共5页

分别采用组织块法和酶消化法分离培养山羊毛囊干细胞,并通过形态学观察、免疫组化染色以及克隆形成率来比较2种方法体外分离培养毛囊干细胞的效率。组织块法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为52.0%±1.62%6、8.4%±1.82%、7... 分别采用组织块法和酶消化法分离培养山羊毛囊干细胞,并通过形态学观察、免疫组化染色以及克隆形成率来比较2种方法体外分离培养毛囊干细胞的效率。组织块法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为52.0%±1.62%6、8.4%±1.82%、72.0%±2.42%,integrin-β1分别为52.5%±2.12%、66.3%±1.98%、73.0%±2.16%,而消化法获得的细胞第1、3、7代K19阳性率分别为56.2%±3.12%、61.7%±1.17%、64.0%±3.02%,integrin-β1分别为56.0%±1.12%、63.0%±1.12%、68.0%±2.32%;组织块法获得的细胞第1、3、7代克隆形成率分别为18.4%±0.77%、31.3%±0.88%、44.7%±1.03%,而消化法获得细胞第1、3、7代克隆形成率为22.6%±2.30%、26.9%±0.86%、32.8%±1.05%;在同样培养条件下,组织块法获得的细胞可体外传19代,而消化法可传12代。结果表明两种方法均能分离得到毛囊干细胞并进行传代,但随着传代次数的增加,组织块法获得的细胞免疫组化染色阳性率、克隆形成率以及传代能力均显著高于酶消化法获得的细胞(P<0.01)。 展开更多

关键词 山羊 毛囊干细胞 组织块 酶消化 克隆形成率

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从原始生殖细胞中分离克隆胚胎干细胞的研究 被引量：3

2

作者 李松 高佩安 +2 位作者 江新泉 窦忠英 苗增民 《中国畜牧兽医》 CAS 2008年第6期64-66,共3页

作者探讨了从原始生殖细胞(PGCs)中分离克隆胚胎干细胞的优势、用于分离克隆胚胎干细胞的PGCs获取方法及其向胚胎干细胞转化的能力。

关键词 原始生殖细胞 分离克隆 胚胎干细胞

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构建组织工程化羊膜角膜上皮植片的研究进展 被引量：8

3

作者 屈雷 王馨 +1 位作者 杨学义 窦忠英 《国际眼科杂志》 CAS 2004年第1期115-120,共6页

虽然组织工程化角膜组织已成功构建,并为体外进行角膜生理、病理、药理和角膜移植等方面的研究提供了与活体角膜很接近的模型,但其距离临床应用还有一定距离。近年来,采用组织工程技术构建的羊膜角膜上皮植片已率先应用于临床,为成千上... 虽然组织工程化角膜组织已成功构建,并为体外进行角膜生理、病理、药理和角膜移植等方面的研究提供了与活体角膜很接近的模型,但其距离临床应用还有一定距离。近年来,采用组织工程技术构建的羊膜角膜上皮植片已率先应用于临床,为成千上万的由于角膜上皮缺损所致的角膜疾病患者带来希望,本文对有关羊膜的基础研究、羊膜负载角膜缘干细胞植片的构建方法及其功能的评价、角膜缘干细胞在羊膜上的生物学特性、植片移植及术后护理等方面的研究进展和存在的问题进行综述。 展开更多

关键词 构建组织工程 羊膜角膜上皮植片 角膜组织 角膜缘干细胞 血清学

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山羊毛囊干细胞分离、培养及鉴定 被引量：5

4

作者 史明艳 高雪 +1 位作者 杨学义 窦忠英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1679-1683,共5页

采用2.4 U/mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶(0.5 mg/mL胰酶+0.2 mg/mLEDTA)消化从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,用自制无血清培养基培养,并用形态学观察、细胞生长曲线、克隆形成率及免疫组化染色检测,探讨毛囊... 采用2.4 U/mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶(0.5 mg/mL胰酶+0.2 mg/mLEDTA)消化从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,用自制无血清培养基培养,并用形态学观察、细胞生长曲线、克隆形成率及免疫组化染色检测,探讨毛囊干细胞体外分离培养方法及生物学特性。结果表明,所分离细胞具备毛囊干细胞特征:体积较小、表面光滑、立体感强,呈现未分化细胞特征;K19、integrin-β1以及p63免疫组化染色阳性;第3、5、7代干细胞克隆形成率分别为25.6%±2.6%、31.8%±1.9%和27.0%±3.9%,极显著高于对照组角质细胞克隆形成率(P<0.01)。采用配制的无血清条件培养液可使山羊毛囊干细胞体外维持未分化状态并传代至19代。 展开更多

关键词 山羊 毛囊干细胞 毛囊隆突部 克隆形成率

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不同浓度的IGF-1对山羊毛囊干细胞体外培养的影响 被引量：5

5

作者 史明艳 高雪 +1 位作者 杨学义 窦忠英 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第5期127-129,共3页

采用2.4 U/mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶(0.5 mg/mL胰酶+0.2 mg/mL EDTA)消化,从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,并检测了不同浓度的IGF-1对山羊毛囊干细胞体外培养的作用。结果表明,IGF-1对毛囊干细胞体外培养... 采用2.4 U/mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶(0.5 mg/mL胰酶+0.2 mg/mL EDTA)消化,从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,并检测了不同浓度的IGF-1对山羊毛囊干细胞体外培养的作用。结果表明,IGF-1对毛囊干细胞体外培养作用很明显,并且最适IGF-1浓度是10 ng/mL。 展开更多

关键词 毛囊干细胞 克隆形成率 IGF-1 体外培养

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构建具有毛囊结构的组织工程皮肤及移植研究 被引量：2

6

作者 史明艳 高雪 +2 位作者 杨学义 窦忠英 许尚忠 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期2097-2104,共8页

旨在构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤,为人类毛发移植和受损皮肤修复的临床应用提供新的思路。试验以山羊毛囊干细胞和真皮细胞为种子细胞,以羊膜、Ⅰ型胶原为支架材料,进行组织工程皮肤的体外构建,并将组织工程皮肤移... 旨在构建具有毛囊、汗腺等皮肤附属器官的组织工程皮肤,为人类毛发移植和受损皮肤修复的临床应用提供新的思路。试验以山羊毛囊干细胞和真皮细胞为种子细胞,以羊膜、Ⅰ型胶原为支架材料,进行组织工程皮肤的体外构建,并将组织工程皮肤移植到山羊体内(试验组,同时以羊膜代替组织工程皮肤进行移植作为对照组),观察和检测其对受损皮肤的修复效果。试验结果表明,人工构建的组织工程皮肤经体外培养25d后,发现有毛囊结构形成;人工皮肤经扫描电镜观察,显示表皮细胞出现角质化;移植30、60、90d后的瘢痕面积显示,试验组创面恢复平整,瘢痕面积极显著小于对照组(P<0.01);移植270d后,活体组织切片检测发现,试验组真、表皮结构已发生重建,可见分化明显的基底层、毛囊结构,而对照组为致密的结缔组织。综上表明,本研究首次以山羊毛囊干细胞和毛囊真皮细胞为种子细胞,成功构建了具有毛囊器官的组织工程皮肤。 展开更多

关键词 山羊 毛囊 干细胞 组织工程皮肤

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大鼠表皮干细胞的分离培养 被引量：2

7

作者 郭延敏 杨学义 +3 位作者 段艳萍 杨春荣 雷安民 冯秀亮 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第9期29-33,共5页

为探索一种简单而又高效的分离大鼠表皮干细胞（ESCs）的方法,采用酶消化法和组织块法对大鼠表皮干细胞进行分离、培养;并用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选大鼠表皮干细胞,免疫组织化学方法检测CK15、P63、β1-integrin和α6-integrin表达情况... 为探索一种简单而又高效的分离大鼠表皮干细胞（ESCs）的方法,采用酶消化法和组织块法对大鼠表皮干细胞进行分离、培养;并用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选大鼠表皮干细胞,免疫组织化学方法检测CK15、P63、β1-integrin和α6-integrin表达情况;同时,测定ESCs单细胞克隆与克隆形成率及表皮干细胞生长曲线。结果表明,采用组织块法和酶消化法均能分离得到大鼠表皮干细胞,获得的细胞生长良好,具有较高的克隆形成率,前者可传至第6代,而后者传至3代~4代便分化;干细胞标记物CK15、P63、β2-integrin和α6-integrin均呈阳性;酶消化法和组织块法均能成功地分离、纯化和培养大鼠表皮干细胞,组织块法相对较好。 展开更多

关键词 表皮干细胞 分离 培养 鉴定 大鼠

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羊膜对山羊角膜缘上皮细胞培养影响的研究

8

作者 赵清梅 王建礼 窦忠英 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第11期116-121,共6页

比较完整羊膜和去上皮羊膜、不同冻存时间的羊膜对山羊角膜缘上皮细胞体外培养的影响,筛选出羊膜最适处理方法。将山羊角膜缘组织块分别接种于完整羊膜、去上皮羊膜、新鲜去上皮羊膜、冻存30d去上皮羊膜、冻存90d去上皮羊膜、冻存180d... 比较完整羊膜和去上皮羊膜、不同冻存时间的羊膜对山羊角膜缘上皮细胞体外培养的影响,筛选出羊膜最适处理方法。将山羊角膜缘组织块分别接种于完整羊膜、去上皮羊膜、新鲜去上皮羊膜、冻存30d去上皮羊膜、冻存90d去上皮羊膜、冻存180d去上皮羊膜上,比较在完整羊膜和去上皮羊膜及不同冻存时间羊膜上角膜缘上皮细胞的生长特性和组织结构。试验结果显示,在去上皮羊膜上角膜缘组织块贴壁和细胞增殖能力较完整羊膜强,角膜缘上皮细胞在2组羊膜上均能形成多层结构,但完整羊膜上形成的组织表层角质化较严重;在冻存30d羊膜上角膜缘组织块贴壁和细胞增殖能力较新鲜羊膜、冻存90d羊膜、冻存180d羊膜强,角膜缘上皮细胞在各组羊膜上均形成多层结构,其结构无明显差异。结果表明,冻存30d去上皮羊膜是构建组织工程人工角膜最适的羊膜载体材料。 展开更多

关键词 羊膜 角膜缘上皮细胞 体外培养

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重组蛋白包涵体的研究进展 被引量：8

9

作者 李军 刘美杰 +1 位作者 李勇 窦忠英 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第31期13552-13554,共3页

在介绍包涵体形成原因、特性及利弊的基础上,重点阐述了包涵体的复性前准备、主要复性方法及提高复性效率的有效措施。

关键词 包涵体 去折叠 蛋白质复性 进展

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尿嘧啶和ATP对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响 被引量：3

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作者 黄伟伟 马晓玲 +4 位作者 雷安民 严兴荣 贾文文 谭晓颖 窦忠英 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2007年第29期9253-9254,9290,共3页

[目的]探究尿嘧啶(Uracil)和三磷酸腺苷二钠盐(ATP)对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响。[方法]在体外成熟培养液中添加不同浓度的尿嘧啶和ATP,研究其对牛卵母细胞体外成熟及激活后孤雌胚胎发育能力的影响。[结果]在成熟培养... [目的]探究尿嘧啶(Uracil)和三磷酸腺苷二钠盐(ATP)对牛卵母细胞成熟及激活后孤雌胚胎发育的影响。[方法]在体外成熟培养液中添加不同浓度的尿嘧啶和ATP,研究其对牛卵母细胞体外成熟及激活后孤雌胚胎发育能力的影响。[结果]在成熟培养液中添加50μg/ml尿嘧啶能够显著提高卵母细胞的成熟率、分裂率及孤雌胚胎囊胚率;在成熟培养液中分别添加0、250、500、750μg/mlATP,对卵母细胞成熟率影响不大,但添加500μg/ml ATP能显著提高激活后孤雌胚胎囊胚率。[结论]该研究为牛卵母细胞IVM研究提供了参考资料。 展开更多

关键词 牛卵母细胞 体外成熟 线粒体 尿嘧啶 ATP

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优化成年家兔皮肤上皮细胞核移植有关参数 被引量：1

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作者 杨春荣 冯秀亮 +3 位作者 雷安民 华进联 高志敏 窦忠英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期441-446,共6页

以成年家兔上皮细胞为核供体,对兔体细胞核移植中孤雌激活、去核、融合、激活及重构胚发育等环节中的有关参数进行筛选和研究.证实160、200和240 V/mm电场强度时的孤雌激活率（77.78%、95.12%、97.30%）无显著差异;200和240 V/mm电场强... 以成年家兔上皮细胞为核供体,对兔体细胞核移植中孤雌激活、去核、融合、激活及重构胚发育等环节中的有关参数进行筛选和研究.证实160、200和240 V/mm电场强度时的孤雌激活率（77.78%、95.12%、97.30%）无显著差异;200和240 V/mm电场强度时的孤雌激活胚囊胚率（52.94%、48.64%）显著高于160 V/mm时（16.67%）;200和240 V/mm电场强度时的重构胚融合率（82.85%、79.78%）无显著差异;200 V/mm电场强度时的重构胚分裂率（71.69%）显著高于240 V/mm时（56.56%）,裂解率（6.82%）显著低于240 V/mm时（17.92%）.在纺锤体观测仪下,第一极体与纺锤体在一起或相距较近的占60%左右.原核明显的重构胚的分裂率（91.75%）极显著的高于观察不到原核的重构胚（42.86%）.重构胚体外培养发育囊胚率（24.39%）低于受精卵原核胚的体外培养的发育率（86.05%）,但两者同自然交配体内发育的囊胚的细胞数（81±17）差异不显著.将646枚2～4细胞重构胚移植到38只同期化或非同期化的受体后没有幼仔出生. 展开更多

关键词 兔 上皮细胞 卵母细胞 孤雌激活 核移植

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家兔角膜内皮细胞的快速培养 被引量：1

12

作者 屈雷 王馨 +1 位作者 杨学义 窦忠英 《国际眼科杂志》 CAS 2004年第2期243-246,共4页

目的:短期内体外扩增获得角膜内皮细胞。方法:采用揭膜法与消化法相结合获取原代角膜内皮细胞。并采用本实验室自行研制的角膜内皮细胞培养体系,在24孔培养板中分别以1×106,5×105,1×105,5×104,1×104,5×10... 目的:短期内体外扩增获得角膜内皮细胞。方法:采用揭膜法与消化法相结合获取原代角膜内皮细胞。并采用本实验室自行研制的角膜内皮细胞培养体系,在24孔培养板中分别以1×106,5×105,1×105,5×104,1×104,5×103细胞/孔浓度传代培养细胞,观察细胞的生长情况。结果:以1×105～5×105个细胞/孔浓度的细胞悬液并添加消化后的Descemet膜原代培养细胞,4d后细胞形成与在体细胞相似的密集单层,可以快速获取纯化的角膜内皮细胞。传代培养时,虽然不同接种浓度在4d的细胞增殖倍数差异不显著,但以1×105～5×105个细胞/孔的浓度传代,3d就可生长成密集单层并可继续传代,现已传至第10代,但传至第4代,细胞形态开始发生改变;而以5×105个细胞/孔以上的浓度传代细胞时,1d的细胞贴壁率下降;以5×104个细胞/孔以下浓度传代,需7d方可长满皿底,并且细胞开始老化,体积变大,不能继续传代培养。或者细胞不能铺满皿底就衰老死亡。结论:本实验的培养体系可在短期内获得实验用角膜内皮细胞。角膜内皮细胞体外培养的增殖能力与其培养浓度和增殖的空间有关,1×105～5×105个细胞/孔的浓度是角膜内皮细胞快速增殖的适宜培养浓度。 展开更多

关键词 家兔 角膜内皮细胞 细胞培养 揭膜法 消化法 细胞增殖

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新生牛雄性生殖细胞源类ES的培养及检测

13

作者 董武子 沈文正 +1 位作者 华进联 窦忠英 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期144-148,共5页

采用贴壁速率差法分离纯化的新生牛雄性生殖干细胞（Male germ stem cell，mGSCs）和支持细胞（Calf sertoli cell，CSCs）；CSCs饲养层细胞一般维持时间不超过8d；新生牛雄性生殖干细胞在CSCs饲养层上1代培养至5～6d可形成类ES细胞集... 采用贴壁速率差法分离纯化的新生牛雄性生殖干细胞（Male germ stem cell，mGSCs）和支持细胞（Calf sertoli cell，CSCs）；CSCs饲养层细胞一般维持时间不超过8d；新生牛雄性生殖干细胞在CSCs饲养层上1代培养至5～6d可形成类ES细胞集落，采用机械离散集落传代法有利于集落形成或存在，传代培养至少在前2代细胞集落存在；部分典型细胞集落的中心细胞AKP强阳性，周边细胞AKP弱阳性或阴性；免疫组化检测显示，细胞集落SSEA1强阳性、SSEA3弱阳性和Oct-4呈现阳性染色。表明mGSCs具有ES细胞的某些细胞特性。 展开更多

关键词 新生牛雄性生殖干细胞 新生牛支持细胞 类ES细胞

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pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定 被引量：2

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作者 李勇 李军 +1 位作者 吕长荣 窦忠英 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2008年第35期15370-15372,15478,共4页

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转... [目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。 展开更多

关键词 GFP HTERT 真核表达载体 构建 鉴定

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