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猪δ冠状病毒(PDCoV)S蛋白的原核表达与鉴定
1
作者 陈濛濛 黄嘉瑶 +6 位作者 彭春婷 高翠翠 王婕 唐斯萍 唐青海 胡意 李小申 《猪业科学》 2025年第2期73-80,共8页
猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型猪肠道致病性冠状病毒,具有高度传染性和致病性,可导致仔猪水样腹泻、呕吐和死亡,对养猪业造成重大经济损失。自2012年在中国香港发布第一份报告以来,PDCoV已在美国、加拿大、... 猪δ冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)是一种新型猪肠道致病性冠状病毒,具有高度传染性和致病性,可导致仔猪水样腹泻、呕吐和死亡,对养猪业造成重大经济损失。自2012年在中国香港发布第一份报告以来,PDCoV已在美国、加拿大、韩国、中国内地、泰国、越南和日本被发现,因此,PDCoV最近表现出全球传播趋势,给养猪业带来更大挑战和风险。PDCoV的病毒粒子呈球形或椭圆形等多形性,是一种正义、单链RNA病毒,基因组约为25.4 kb,是现今已知的最小的冠状病毒。PDCoV编码15种成熟的非结构蛋白(nsp 2~nsp 16),四种结构蛋白(纤突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白)和三种辅助蛋白(NS6、NS7和NS7a)。 展开更多
关键词 高度传染性 重大经济损失 水样腹泻 养猪业 非结构蛋白 猪肠道 核衣壳 纤突
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永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用
2
作者 唐青海 刘博 +6 位作者 谢金文 魏凤 谷英华 高翠翠 曹宗喜 张艳 王文秀 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第2期22-31,共10页
【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代... 【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。 展开更多
关键词 猪视网膜色素上皮细胞 永生化 猪流行性腹泻病毒 猪圆环病毒2型 猪伪狂犬病毒
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大肠杆菌裂解性噬菌体内溶素的表达与活性研究 被引量：1
3
作者 赵铖 吴慧蓉 +6 位作者 唐艺彤 李小申 赵婷芳 高翠翠 杨海 胡意 唐青海 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1191-1195,共5页
为制备大肠杆菌裂解性噬菌体内溶素(Endolysin)并分析其抑菌活性,本研究利用PCR扩增endolysin基因,克隆至低温表达载体pCold GST、转化Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株pCold-endolysin/Rosetta(DE3),酶切及测序鉴定结果显示与... 为制备大肠杆菌裂解性噬菌体内溶素(Endolysin)并分析其抑菌活性,本研究利用PCR扩增endolysin基因,克隆至低温表达载体pCold GST、转化Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株pCold-endolysin/Rosetta(DE3),酶切及测序鉴定结果显示与预期一致,插入序列正确。将该重组菌经终浓度0.2 mmol/L IPTG诱导2 h表达重组endolysin蛋白(r-endolysin),采用GST蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白、经SDS-PAGE和western blot检测,采用Bradford法测定r-endolysin浓度。经滴板计数后采用活菌稀释计数法测定r-endolysin蛋白对大肠杆菌的体外裂解活性。SDS-PAGE和western blot检测结果显示,r-endolysin分子量约35 ku,且主要以可溶性形式表达,经纯化后获得35 ku单一目的条带,蛋白浓度经测定为0.54 mg/mL。体外抑菌活性试验结果显示,与其他组相比,EDTA+r-endolysin组的抑菌效果极显著增强(P<0.0001),且呈时间依赖性,EDTA+PBS组的抑菌效果优于r-endolysin+PBS组。本研究所制备的r-endolysin蛋白抑菌活性较好,这为进一步开发致病性大肠杆菌的新型抑菌制剂奠定了扎实基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌 噬菌体 内溶素 原核表达 抑菌活性
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猪胆囊收缩素与生长抑素的融合表达与鉴定
4
作者 赵婷芳 赵铖 +5 位作者 黄嘉瑶 刘婷 曾沛暄 黄晶 唐青海 唐斯萍 《现代畜牧兽医》 2024年第10期1-6,共6页
研究旨在运用原核表达系统制备重组猪胆囊收缩素与生长抑素融合蛋白(rpCCK-SS)。人工合成猪胆囊收缩素与生长抑素融合基因(pCCK-SS),分别克隆至pET28a和pCold GST载体中,转化BL21 (DE3)或Transetta (DE3),构建重组表达菌株,采用双酶切... 研究旨在运用原核表达系统制备重组猪胆囊收缩素与生长抑素融合蛋白(rpCCK-SS)。人工合成猪胆囊收缩素与生长抑素融合基因(pCCK-SS),分别克隆至pET28a和pCold GST载体中,转化BL21 (DE3)或Transetta (DE3),构建重组表达菌株,采用双酶切和测序鉴定;并通过进行SDS-PAGE检测和Western blot鉴定优化诱导剂浓度和诱导时间。结果显示,pCCK-pSS基因全长693 bp,共编码231 aa;BL21 (DE3)-pET28apCCK-SS表达目的蛋白分子量25 kDa,以包涵体形式存在;Transetta (DE3)-pCold-pCCK-SS表达目的蛋白分子量50 kDa,在上清与沉淀中均有表达,以沉淀中的包涵体形式为主,最优表达条件为15℃、0.25 mmol/L IPTG浓度诱导8 h。研究表明,试验成功运用两个表达载体表达了rpCCK-SS,且pCold GST的表达效果优于pET28a,为进一步开发新型促生长制剂奠定了基础。 展开更多
关键词 猪胆囊收缩素 猪生长抑素 低温诱导 融合表达
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猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达与鉴定
5
作者 朱钰英 高翠翠 +6 位作者 唐青海 刘婷 赵婷芳 曾沛暄 赵铖 胡意 李小申 《湖南畜牧兽医》 2024年第2期35-38,共4页
[目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋... [目的]研究旨在扩增PCV3病毒的Cap基因,体外表达PCV3 Cap蛋白。[方法]试验分别建立重组原核表达载体p ET28a-PCV3-Cap和p Cold-PCV3-Cap,转化Rosetta(DE3)表达菌株,在不同温度条件下诱导表达蛋白,采用SDS-PAGE和Western blotting进行蛋白鉴定。[结果]PCV3 Cap蛋白在p ET28a原核表达系统中无表达;Rosetta-p Cold-PCV3-Cap在诱导温度为15℃、IPTG浓度为1.0 mmo L/L、诱导4 h的条件下,能够表达分子量约为25 k Da的Cap蛋白,且为可溶性表达。[结论]试验成功制备了PCV3 Cap蛋白,为制备PCV3疫苗及其诊断方法的研究提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型(PCV3) CAP蛋白 原核表达 鉴定
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音乐对猪的影响研究进展
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作者 唐小武 曾淑娟 +5 位作者 张嘉欣 尹怡萍 刘莹莹 杜云德 米春英 杨灿 《猪业科学》 2024年第2期112-114,共3页
猪只具有和人类非常相似的耳蜗,小型猪耳蜗的精细结构包括前庭鳞片、鼓膜鳞片、鼓膜鳞片、齿状骨、齿状骨韧带和耳蜗隔断,可以感知声音。声振动的频率以赫兹(Hz)为单位,猪只的听觉范围从42~40.5 kHz,最佳灵敏度区域从250~16 kHz。音乐... 猪只具有和人类非常相似的耳蜗,小型猪耳蜗的精细结构包括前庭鳞片、鼓膜鳞片、鼓膜鳞片、齿状骨、齿状骨韧带和耳蜗隔断,可以感知声音。声振动的频率以赫兹(Hz)为单位,猪只的听觉范围从42~40.5 kHz,最佳灵敏度区域从250~16 kHz。音乐能影响动物的情绪、学习和记忆能力。 展开更多
关键词 声振动 听觉范围 小型猪 耳蜗 齿状骨 鼓膜 学习和记忆能力 精细结构
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犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备 被引量：1
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作者 薛姣雄 赵婷芳 +9 位作者 张倩 唐青海 高翠翠 赵铖 张妍 全飞杨 刘婷 杨灿 杨海 王文秀 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第11期2568-2583,共16页
为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构... 为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株;用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白;纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原,免疫蛋鸡,用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体,通过Western blot检测抗体滴度,用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示,S1蛋白全长无表达,CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应,胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上,本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白,制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。 展开更多
关键词 犬冠状病毒 原核表达 佐剂 卵黄抗体 小分子抗体Fab
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猪CD163基因的克隆及截短原核表达
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作者 刘雪晴 张可 +6 位作者 唐青海 薛姣雄 隆泽桧 高翠翠 刘之睿 苏荣 唐斯萍 《湖南畜牧兽医》 2023年第2期30-36,共7页
(目的)研究旨在克隆猪CD163 (pCD163)基因、体外表达CD163蛋白。(方法)采用RT-PCR扩增猪CD163基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列,将猪CD163的两个截短基因片段(1-1749 bp和1717-3348 bp)克隆至原核表达载体pGEX-4T-1... (目的)研究旨在克隆猪CD163 (pCD163)基因、体外表达CD163蛋白。(方法)采用RT-PCR扩增猪CD163基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列,将猪CD163的两个截短基因片段(1-1749 bp和1717-3348 bp)克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组原核表达载体,转化Transetta(DE3)菌株,IPTG诱导蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。(结果)结果表明,pCD163开放阅读框为3348 bp(GenBank:OM321546),编码1116 aa,蛋白分子量为120.5 kDa,该基因与已经测定的人、绿猴、牛、狼的CD163的核苷酸相似性依次为87.8%、88%、87.4%和88%,pCD163基因与抹香鲸和牛的CD163基因亲缘关系最近,与人、狼和绿猴的亲缘关系相对较近;pCD163截短片段1-1749蛋白分子量为92 kDa,截短片段1717-3348蛋白分子量为85 kDa,均以包涵体形式表达。(结论)试验成功克隆了pCD163基因,两个截短基因片段在原核细胞中均以包涵体形式表达,为后续开展该蛋白生物学功能研究提供了基础材料。 展开更多
关键词 猪CD163蛋白 进化分析 诱导 表达 包涵体
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柞市麻羊生产性能及肉品质研究
9
作者 赵丹 王晓娟 +5 位作者 张亚兰 杨灿 唐小武 刘会敬 易诚 张旗 《湖南畜牧兽医》 2023年第6期9-13,共5页
试验旨在对特色羊品种柞市麻羊的生产性能及肉质性状进行详细的介绍。采集柞市麻羊的背最长肌和股四头肌,采用国标法测定其胴体性能、肉质性状、质构特性、肌纤维特性以及肌肉的常规营养成分。结果表明,不同月龄柞市麻羊的宰前活重介于2... 试验旨在对特色羊品种柞市麻羊的生产性能及肉质性状进行详细的介绍。采集柞市麻羊的背最长肌和股四头肌,采用国标法测定其胴体性能、肉质性状、质构特性、肌纤维特性以及肌肉的常规营养成分。结果表明,不同月龄柞市麻羊的宰前活重介于20.00~26.50 kg、胴体重介于8.50~11.40 kg、屠宰率介于42.50%~43.01%。麻羊羊肉粗蛋白含量介于9.13%~12.25%,粗脂肪含量介于0.93%~1.08%,钙、磷含量分别介于2.24%~3.36%和0.31%~0.42%。麻羊胸部肌肉的红度(a*值)和黄度(b*值)低于腿部,亮度(L*值)则相反;麻羊胸部肌肉的系水力较腿部好,p H和熟肉率低于腿部,新鲜腿部肌肉剪切力值低于胸部,蒸煮后则相反。麻羊胸部肌肉的硬度、胶着性和咀嚼性高于腿部,黏附性、回复性、内聚性以及弹性没有较大差异。麻羊胸部的肌纤维密度、细胞直径以及细胞面积都高于腿部。综上说明,柞市麻羊羊肉是一种高蛋白、低脂肪的优质蛋白质肉食品,具有较强的市场竞争优势和广泛的养殖前景。 展开更多
关键词 柞市麻羊 生产性能 肉质性状 质构特性
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