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IDO基因重组慢病毒载体构建及其转染hUCMSCs细胞的实验研究
1
作者
李玉云
李见
+3 位作者
王露
翟玮玮
吴正中
张强
《华中科技大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第4期395-400,423,共7页
目的构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法将IDO基因...
目的构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法将IDO基因克隆至慢病毒pGC-FU-EGFP表达载体中,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;制备携带IDO基因的慢病毒Lentivirus-IDO,并测定重组慢病毒的滴度。用重组慢病毒以最佳MOI值感染hUCM-SCs作为实验组,以空载体转染的hUCMSCs(空载体组)及未转染的hUCMSCs(未转染组)作为对照,应用RT-PCR及Western blot法分别检测细胞中IDO mRNA及IDO蛋白水平的表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定pGC-FU-EGFP-IDO重组慢病毒表达载体构建成功,包装慢病毒Lentivirus-IDO滴度为2×108 TU/mL。通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为30,此时对细胞的转染效率可达到80%以上。RT-PCR检测显示实验组IDO mRNA表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性;Western blot检测示实验组细胞内IDO蛋白表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性。结论成功构建了人IDO基因的重组慢病毒表达载体,慢病毒Lentivirus-IDO能有效感染hUCMSCs,IDO蛋白可在hUCMSCs中长期、稳定表达。
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关键词
再生障碍性贫血
人脐带间充质干细胞
吲哚胺2
3-过氧化酶
绿色荧光蛋白
慢病毒载体
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职称材料
题名
IDO基因重组慢病毒载体构建及其转染hUCMSCs细胞的实验研究
1
作者
李玉云
李见
王露
翟玮玮
吴正中
张强
机构
蚌埠医学院医学检验系临床检验诊断学实验中心
出处
《华中科技大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第4期395-400,423,共7页
基金
安徽省高等学校省级自然科学研究项目(No.Kj2010B118)
安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目(No.Kj2012A198)
安徽省蚌埠市科技计划项目(No.蚌科[2011]33)
文摘
目的构建共同表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的慢病毒表达载体,探讨其在人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)中的表达,为下一步利用高表达IDO的hUCMSCs移植治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法将IDO基因克隆至慢病毒pGC-FU-EGFP表达载体中,通过PCR和测序鉴定获得连接正确的克隆。重组慢病毒表达载体质粒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;制备携带IDO基因的慢病毒Lentivirus-IDO,并测定重组慢病毒的滴度。用重组慢病毒以最佳MOI值感染hUCM-SCs作为实验组,以空载体转染的hUCMSCs(空载体组)及未转染的hUCMSCs(未转染组)作为对照,应用RT-PCR及Western blot法分别检测细胞中IDO mRNA及IDO蛋白水平的表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定pGC-FU-EGFP-IDO重组慢病毒表达载体构建成功,包装慢病毒Lentivirus-IDO滴度为2×108 TU/mL。通过EGFP表达的阳性细胞数筛选其最适MOI为30,此时对细胞的转染效率可达到80%以上。RT-PCR检测显示实验组IDO mRNA表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性;Western blot检测示实验组细胞内IDO蛋白表达阳性,空载体组和未转染组均为阴性。结论成功构建了人IDO基因的重组慢病毒表达载体,慢病毒Lentivirus-IDO能有效感染hUCMSCs,IDO蛋白可在hUCMSCs中长期、稳定表达。
关键词
再生障碍性贫血
人脐带间充质干细胞
吲哚胺2
3-过氧化酶
绿色荧光蛋白
慢病毒载体
Keywords
aplastic anemia
human umbilical cord mesenchymal stem cells
IDO
green fluorescent protein
lentiviral vector
分类号
R556.5 [医药卫生—血液循环系统疾病]
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作者
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1
IDO基因重组慢病毒载体构建及其转染hUCMSCs细胞的实验研究
李玉云
李见
王露
翟玮玮
吴正中
张强
《华中科技大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2013
0
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