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布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法的建立与初步验证
1
作者 姚梦欣 彭泽宇 +5 位作者 任文浩 徐艺玫 郭伟 陈创夫 马忠臣 王勇 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第3期255-262,共8页
目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌... 目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌来验证该方法的特异性;通过对灭活布鲁氏菌梯度稀释液的检测,验证该方法的灵敏性;将该夹心ELISA检测结果与试管凝集和qPCR检测结果进行比较。结果 筛选出的捕获抗体为4A12,检测抗体为6C12。试验分析显示,捕获抗体4A12的最佳包被浓度为5μg/mL,检测抗体6C12的最佳稀释比为1∶2 000。该研究的最佳包被条件为4℃过夜、5%脱脂奶粉封闭、封闭时间2 h。该研究建立的双抗体夹心ELISA方法只与布鲁氏菌发生反应,与其他细菌未发生反应;布鲁氏菌灭活菌液浓度稀释到1×10^(5) CFU/mL时仍能检测出。批内、批间变异系数均小于10%。结论 该研究成功建立了布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性与灵敏性,为布鲁氏菌病的精确诊断和有效防控提供有效途径。 展开更多
关键词 单克隆抗体 布鲁氏菌 双抗夹心ELISA法 诊断
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牛种布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株生物学特性及其免疫原性研究 被引量：2
2
作者 徐朕宇 邓肖玉 +7 位作者 王月丽 孙灿 吴澳迪 曹剑 易继海 王勇 王震 陈创夫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2135-2145,共11页
布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失... 布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)效应物BtpA是布鲁氏菌的重要免疫抑制分子之一。为了进一步了解BtpA对牛种布鲁氏菌生物学特性的影响,并探究BtpA基因缺失是否会影响布鲁氏菌的免疫原性。在牛种布鲁氏菌疫苗株(A19株)上对BtpA基因进行了缺失,通过qRT-PCR检测布鲁氏菌A19ΔBtpA缺失株中的BtpA mRNA表达水平,并探究布鲁氏菌A19株和A19ΔBtpA缺失株在生长曲线、胞内生存、黏附侵袭和体外应激方面的差异。此外,将A19株和A19ΔBtpA缺失株免疫小鼠,在免疫后的第7、14、21、28和35天使用间接ELISA检测小鼠体内的布鲁氏菌特异性抗体水平;通过ELISpot检测免疫第21天时小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的表达水平,利用流式细胞术测定了小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞的分类情况。结果表明:成功构建了A19ΔBtpA缺失株,A19ΔBtpA缺失株中BtpA的转录水平显著低于A19株,A19ΔBtpA缺失株与亲本株在生长曲线、胞内生存和黏附侵袭方面呈现相似的趋势。而体外应激试验显示,高渗应激条件下A19ΔBtpA缺失株的存活菌量明显低于A19株(P<0.05)。免疫原性研究中,与PBS组相比,A19组和A19ΔBtpA组均可极显著诱导小鼠产生布鲁氏菌特异性抗体(P<0.01);与A19组相比,A19ΔBtpA组淋巴细胞IFN-γ表达水平显著升高(P<0.05),使小鼠产生的IFN-γ阳性CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞以及CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比值显著增高(P<0.05)。BtpA基因缺失不会影响布鲁氏菌A19体外胞内增殖,但可能参与布鲁氏菌抗高渗环境能力相关。此外,A19ΔBtpA缺失株比A19株更好地诱导Th1型免疫应答,诱导宿主产生与A19株相当的IgG特异性抗体,具有布鲁氏菌基因缺失疫苗的潜力。该研究将为进一步探究布鲁氏菌的致病机制和开发基因缺失株疫苗提供理论基础和数据支持。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BtpA 生物学特性 免疫原性
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布鲁氏菌BspF蛋白生物信息学分析及其对巨噬细胞炎症因子表达的影响 被引量：2
3
作者 孙灿 魏硕 +6 位作者 鄢余静 赵天艺 朱德馨 邓兴梅 郭嘉 张辉 孙志华 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1846-1856,共11页
【目的】对布鲁氏菌BspF蛋白进行生物信息学分析,并进一步探究BspF蛋白对巨噬细胞炎症因子表达的影响。【方法】利用生物信息学在线软件分析布鲁氏菌BspF蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、跨膜区、抗原决定簇及结构域、二级结构、三... 【目的】对布鲁氏菌BspF蛋白进行生物信息学分析,并进一步探究BspF蛋白对巨噬细胞炎症因子表达的影响。【方法】利用生物信息学在线软件分析布鲁氏菌BspF蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、跨膜区、抗原决定簇及结构域、二级结构、三级结构。构建重组质粒pET-32a-BspF并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导表达BspF蛋白并进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting检测蛋白表达及纯化情况。通过CCK-8法检测纯化后BspF蛋白对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的毒性,利用实时荧光定量PCR和Western blotting分别检测BspF蛋白对细胞中炎症相关因子mRNA和蛋白表达的影响。【结果】BspF蛋白分子质量为48.75 ku,属于不稳定蛋白,具有15个抗原决定簇,不存在跨膜区域和信号肽,二级结构以α-螺旋为主。成功构建了布鲁氏菌BspF基因原核表达载体,诱导表达后获得大小为60 ku的目标蛋白。纯化后蛋白以50μg/mL终浓度刺激RAW264.7细胞24 h后,与对照组相比,BspF组细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA表达量均显著或极显著升高(P<0.05;P<0.01),NLRP3、Pro-Caspase-1蛋白表达量均极显著升高(P<0.01)。【结论】布鲁氏菌BspF蛋白能通过NLRP3炎症小体触发宿主细胞炎症反应,促进巨噬细胞炎症因子的表达。结果为布鲁氏菌致炎机制的研究和抗炎靶点的筛选提供理论基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BspF蛋白 生物信息学 原核表达 炎性因子
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布鲁氏菌T4SS效应蛋白BspJ的生物学功能研究
4
作者 承潇潇 任文浩 +6 位作者 郑炜 姚梦欣 徐艺玫 李芮芮 陈创夫 马忠臣 王勇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期895-901,共7页
为探究布鲁氏菌IV型分泌系统(T4SS)效应蛋白BspJ的生物学功能,本研究利用同源重组和载体回补方法,以粗糙型牛种布鲁氏菌(RB51)为亲本株,构建布鲁氏菌BspJ基因缺失菌株(ΔBspJ)与BspJ基因回补株(pBspJ),并经PCR和测序鉴定。将ΔBspJ与p B... 为探究布鲁氏菌IV型分泌系统(T4SS)效应蛋白BspJ的生物学功能,本研究利用同源重组和载体回补方法,以粗糙型牛种布鲁氏菌(RB51)为亲本株,构建布鲁氏菌BspJ基因缺失菌株(ΔBspJ)与BspJ基因回补株(pBspJ),并经PCR和测序鉴定。将ΔBspJ与p BspJ连续传代至15代,经PCR鉴定ΔBspJ与pBspJ的遗传稳定性,结果显示,正确构建了ΔBspJ与pBspJ,且各代次ΔBspJ均未扩增出目的条带、p BspJ均扩增出目的条带,二者遗传稳定性好。将RB51、ΔBspJ、pBspJ分别于酸性(p H2.5/37℃)、碱性(pH11.5/37℃)、高盐(1.5 mol/L NaCl/37℃)及热休克(pH7.0/50℃)等不同体外条件下培养,统计各菌株生存率;将RB51、ΔBspJ、p BspJ分别以感染复数(MOI)100侵染小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)后,采用q RT-PCR检测凋亡相关因子基因BAX、BCL2、CASP3、CASP8及炎症相关因子基因CDK2、m TOR、TRAF3IP2、P62、IL-8的转录水平;另外,于侵染后24 h、48 h时分别裂解上述3种侵染细胞,计数各菌株的细菌菌落总数(CFU),分析各菌株的胞内生存能力。结果显示,相比于RB51,ΔBspJ在pH2.5/37℃的TSB液体培养基中的生存率极显著下降(P<0.01),在pH11.5/37℃、pH7.0/50℃、1.5 mol/L NaCl/37℃的TSB液体培养基中的生存率极显著下降(P<0.001);相比RB51侵染的RAW264.7细胞,ΔBsp J侵染的RAW264.7细胞中BAX、CASP3、CASP8基因的转录水平极显著升高(P<0.001),BCL2基因的转录水平极显著下降(P<0.001),TRAF3IP2基因的转录水平极显著升高(P<0.0001),P62基因转录水平极显著升高(P<0.01),IL-8、mTOR基因的转录水平显著升高(P<0.05),CDK2基因的转录水平无显著差异(P>0.05)。相比RB51,ΔBspJ的胞内生存能力在侵染24 h后显著下降(P<0.01),48 h后极显著下降(P<0.001)。上述试验中亲本株RB51组与回补株p BspJ组检测结果均无显著差异(P>0.05)。综上所述,本研究首次证实BspJ参与调控布鲁氏菌酸碱稳态和渗透压稳态,揭示了BspJ通过抑制宿主细胞的凋亡与炎症反应显著提高布鲁氏菌的胞内生存能力,为T4SS效应蛋白BspJ对布鲁氏菌致病机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BspJ基因 基因功能 凋亡 炎症
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嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1调控宿主细胞剪接体转录机制的初步分析
5
作者 李芮芮 史梦华 +5 位作者 张妍 何洪琴 王雨璐 陈佳 王勇 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期39-48,共10页
为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1对宿主细胞内蛋白表达的影响,并初步分析Ats-1对宿主细胞剪接体的调控机制,本研究将嗜吞噬无形体的Ats-1基因克隆后连接至pcDNA3.1质粒,构建pcDNA3.1-Ats-1重组质粒,经PCR和测序鉴定正确后利用脂质体Lip... 为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1对宿主细胞内蛋白表达的影响,并初步分析Ats-1对宿主细胞剪接体的调控机制,本研究将嗜吞噬无形体的Ats-1基因克隆后连接至pcDNA3.1质粒,构建pcDNA3.1-Ats-1重组质粒,经PCR和测序鉴定正确后利用脂质体LipofectamineTM3000将其转染HEK293T细胞,继续培养至24 h、48 h时经western blot鉴定,结果显示,在48 ku(全长蛋白)和35 ku(成熟蛋白)出现特异性条带,表明Ats-1蛋白在细胞内可正确表达;且相较于24 h,48 h Ats-1蛋白在细胞内的表达量显著增加(P<0.05)。将重组质粒pcDNA3.1-Ats-1和空质粒pcDNA3.1分别转染HEK293T细胞,48 h后收获细胞并裂解取裂解液,利用同量异位标签定量蛋白质组学方法(iTRAQ)筛选Ats-1表达后宿主细胞内差异显著表达的蛋白,并采用基因本体论(GO)分析差异显著表达蛋白的功能,利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库分析差异显著表达蛋白参与的信号通路。从剪接体通路选取34个差异表达蛋白通过q RT-PCR验证。i TRAQ结果显示,与空质粒转染细胞组相比,重组质粒pcDNA3.1-Ats-1转染细胞组共鉴定到852个差异显著表达的蛋白,其中表达显著上调蛋白406个,表达显著下调蛋白446个。GO功能分析结果显示,差异显著表达蛋白主要定位在膜、胞内膜结合细胞器、膜组分,参与大分子生物合成过程,有核酸和RNA结合活性。KEGG信号通路分析结果显示,差异显著表达蛋白显著富集于剪接体、N-糖基化、蛋白输出和RNA运输等信号通路。q RT-PCR结果显示,剪接体通路富集的差异显著表达蛋白仅O43143蛋白的m RNA转录水平上调,其他33个蛋白(A0A024R1K8、Q13435、Q13573等)m RNA的转录水平均显著下调,与iTRAQ的分析结果一致。综上所述,本研究首次证实Ats-1蛋白表达后可能参与宿主细胞中剪接体、N-糖基化和蛋白输出信号通路的调控,抑制宿主细胞中剪接体调控通路中部分蛋白的转录,从而可能抑制剪接体调控,该结果为研究嗜吞噬无形体效应蛋白Ats-1在宿主细胞中的调控机制提供了新的方向和思路。 展开更多
关键词 Ats-1蛋白 ITRAQ 差异表达蛋白 剪接体
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布鲁氏菌OMP10介导的小鼠骨髓源树突状细胞活化及其对小鼠T细胞增殖影响的研究 被引量：4
6
作者 徐朕宇 王月丽 +8 位作者 易继海 童志霞 邓肖玉 杨宁宁 徐明国 王勇 孟闯 苗玉和 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1084-1090,共7页
为探究布鲁氏菌外膜蛋白10(OMP10)介导小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)的活化机制及其对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。本研究通过体外分离培养BMDC细胞6 d后,将重组OMP10(rOMP10)与BMDC共孵育24 h,经流式细胞术分析BMDC表面共刺激分子(CD40、... 为探究布鲁氏菌外膜蛋白10(OMP10)介导小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)的活化机制及其对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。本研究通过体外分离培养BMDC细胞6 d后,将重组OMP10(rOMP10)与BMDC共孵育24 h,经流式细胞术分析BMDC表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导细胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达量显著升高(P<0.001)。同时采用ELISA检测共孵育后BMDC细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-10、IL-4)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导其细胞因子(IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ)表达量极显著升高(P<0.01),但IL-4和IL-10的表达量极显著降低(P<0.001)。进一步采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测共孵育后BMDC的Toll样受体(TLRs)和MHC-I、MHC-II类分子的mRNA转录水平,结果显示,与PBS组相比,rOMP10能够诱导BMDC的TLR2和TLR4(P<0.05),以及抗原递呈相关分子MHC-I和MHC-II的mRNA转录水平极显著升高(P<0.01)。另外,将小鼠脾脏T淋巴细胞与rOMP10预处理的BMDC共孵育后,经MTT试验检测T淋巴细胞增殖效率,结果显示,rOMP10处理组比PBS组T淋巴细胞的刺激指数增加2倍以上,且在树突状细胞和淋巴细胞比值(DCs:T)为1:50时,rOMP10处理组的T淋巴细胞增殖效率最高。综上所述,本研究首次证实布鲁氏菌OMP10能够诱导BMDC的活化,促进抗原递呈分子的转录,从而介导T淋巴细胞的高效增殖,该结果为解析布鲁氏菌感染与宿主免疫机制奠定实验基础,同时也为布鲁氏菌新型亚单位疫苗研发提供数据支持。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白OMP10 小鼠骨髓源树突状细胞 抗原递呈 T淋巴细胞增殖
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布鲁氏菌外膜囊泡生物信息学分析及免疫原性评价 被引量：5
7
作者 徐朕宇 徐锦凤 +9 位作者 邓肖玉 王月丽 何金科 谢珊珊 王震 易继海 王勇 苗玉和 崔丽瑾 陈创夫 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2906-2914,共9页
【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态... 【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态和组分分析;使用纳米佐剂(LDH)和弗氏佐剂乳化OMVs后免疫小鼠,通过间接ELISA方法检测免疫后7、14、21、28和35 d小鼠血清中的特异性抗体,利用小鼠IgG ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠血清中IgG抗体水平,评估OMVs诱导产生的体液免疫水平;通过小鼠脾脏淋巴细胞分离与细胞因子白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)测定及小鼠外周血T淋巴细胞亚群的流式细胞术测定评估OMVs免疫小鼠的细胞免疫水平。【结果】成功提取并纯化了布鲁氏菌OMVs,其直径大小为20~160 nm。生物信息学分析结果显示,OMVs主要组成蛋白OMP25、OMP31、OMP16、OMP19、BP26及SOD均属于亲水性蛋白和抗原性蛋白,且存在多个B细胞和T细胞优势抗原表位。与PBS组相比,OMVs免疫小鼠后,不同佐剂组均可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体和IgG抗体(P<0.01);同时OMVs可显著诱导小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ(P<0.05),并促进了CD4^(+)T细胞的表达(P<0.05)。【结论】本研究证实了羊种布鲁氏菌OMVs具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应,为布鲁氏菌新型亚单位疫苗的开发奠定了理论基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜囊泡(OMVs) 免疫原性
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猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价 被引量：2
8
作者 肖莉 牛小杰 +3 位作者 刘庆庆 王月丽 陈创夫 易继海 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期260-269,共10页
【目的】构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列(登录号:MH898990.1)合成PoRV VP4基因,将得... 【目的】构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列(登录号:MH898990.1)合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过PmeⅠ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行PacⅠ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50);通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为106.5TCID50,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用106.5TCID50rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于105.3TCID50TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平(P<0.05);106.5TCID50rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于105.5和104.5TCID50rAd-VP4(P<0.05),而105.5TCID50rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于106.5和104.5TCID50rAd-VP4(P<0.05)。106.5TCID50rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著(P>0.05)。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为106.5TCID50。106.5和105.5TCID50rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。 展开更多
关键词 猪轮状病毒(PoRV) 重组腺病毒载体 IGG抗体水平
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布鲁氏菌分泌蛋白BspI生物信息学分析及多克隆抗体制备 被引量：1
9
作者 肖洋洋 马忠臣 +4 位作者 李芮芮 陈创夫 郑炜 王勇 王鹏雁 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第8期3112-3121,共10页
【目的】试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌... 【目的】试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌16M株BspI基因序列(GenBank登录号:DK63_1233)设计引物,PCR扩增目的基因后连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆,将目的基因连接到pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE分析,用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,纯化后的蛋白与弗氏佐剂混合免疫试验兔,采血分离血清,通过Western blotting、间接ELISA法进行多克隆抗体特异性及抗体效价分析。【结果】BspI蛋白为不稳定亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽区域,有13个磷酸化位点和7个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。PCR成功扩增出675 bp的BspI基因,成功构建了pET-28a-BspI表达载体。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达出25.3 ku的蛋白,纯化后无明显杂带,制备的多克隆抗体能够特异性地与BspI蛋白结合。间接ELISA结果显示,BspI蛋白多克隆抗体效价为1∶409600。【结论】制备的兔源BspI蛋白多克隆抗体可以特异性识别BspI蛋白,该蛋白具有较好的反应原性。试验结果为进一步研究BspI蛋白在布鲁氏菌的胞内寄生中发挥的作用提供了参考。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 生物信息分析 分泌蛋白BspI 多克隆抗体
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