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伪结核棒状杆菌磷脂酶D蛋白的表达及间接ELISA方法的建立与应用
1
作者
白婕妤
孙婧
+5 位作者
黄宇璇
王聚涛
杜金鑫
夏利宁
张万江
李刚
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025年第8期826-831,共6页
为建立羊伪结核棒状杆菌(Cp)的快速检测方法,本研究经PCR从Cp模式株ATCC19410中扩增磷脂酶D(PLD)编码基因,将其克隆至pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-PLD,经测序鉴定正确的该质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后切胶纯化,...
为建立羊伪结核棒状杆菌(Cp)的快速检测方法,本研究经PCR从Cp模式株ATCC19410中扩增磷脂酶D(PLD)编码基因,将其克隆至pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-PLD,经测序鉴定正确的该质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后切胶纯化,采用SDS-PAGE检测重组PLD蛋白(rPLD)的表达及纯化效果,经western blot检测其反应原性。结果显示,在37 ku处出现目的条带,且纯化效果好,该蛋白具有较好的反应原性。以纯化的rPLD为包被抗原,采用方阵法优化间接ELISA各反应条件,结果显示最佳抗原包被浓度为每孔100 ng、待检血清最佳稀释倍数为1:50、血清孵育时间为0.5 h、最佳封闭液为2%明胶、封闭时间2 h、兔抗山羊IgG-HRP的最佳稀释倍数为1:20000、二抗孵育时间1 h、抗体阴阳性临界值为0.432,表明初步建立了检测Cp血清抗体的间接ELISA方法。利用该ELISA方法检测Cp、山羊痘病毒、羊支原体、结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、小反刍兽疫病毒、羊布鲁氏菌的阳性血清,结果显示,除Cp外其余病原的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将Cp阳性血清2倍倍比稀释后利用该ELISA方法检测,结果显示,该方法对阳性血清的检测限为稀释度1:640,该方法敏感性较高。利用5份Cp阳性血清和3份Cp阴性血清进行重复性试验,结果显示,该ELISA方法批内、批间重复性试验的最大变异系数分别为5.53%和7.79%,重复性较好。利用该ELISA方法和菌体凝集抑制试验对50份临床血清样品检测,结果显示,二者的阳性符合率为88.9%,阴性符合率为88.5%,总符合率为88.7%。进一步利用该ELISA方法对451份黑龙江省部分地区羊场的血清样品检测,结果显示,Cp抗体阳性率为51%(230/451),表明黑龙江省部分地区羊场导致羊干酪性淋巴结炎(CLA)的Cp感染率较高。本研究建立的间接ELISA方法为Cp血清抗体的检测提供了候选的技术手段,为Cp感染的早期检测和流行病学研究提供了有力技术支撑。
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关键词
结核棒状杆菌
磷脂酶D
间接ELISA
抗体检测
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职称材料
题名
伪结核棒状杆菌磷脂酶D蛋白的表达及间接ELISA方法的建立与应用
1
作者
白婕妤
孙婧
黄宇璇
王聚涛
杜金鑫
夏利宁
张万江
李刚
机构
新疆农业大学动物医学学院
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室/动物细菌病创新团队
绥棱县靠山乡农技推广服务中心
出处
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025年第8期826-831,共6页
基金
国家自然科学基金(32373013、32172853)。
文摘
为建立羊伪结核棒状杆菌(Cp)的快速检测方法,本研究经PCR从Cp模式株ATCC19410中扩增磷脂酶D(PLD)编码基因,将其克隆至pET-28a中构建重组表达质粒pET-28a-PLD,经测序鉴定正确的该质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后切胶纯化,采用SDS-PAGE检测重组PLD蛋白(rPLD)的表达及纯化效果,经western blot检测其反应原性。结果显示,在37 ku处出现目的条带,且纯化效果好,该蛋白具有较好的反应原性。以纯化的rPLD为包被抗原,采用方阵法优化间接ELISA各反应条件,结果显示最佳抗原包被浓度为每孔100 ng、待检血清最佳稀释倍数为1:50、血清孵育时间为0.5 h、最佳封闭液为2%明胶、封闭时间2 h、兔抗山羊IgG-HRP的最佳稀释倍数为1:20000、二抗孵育时间1 h、抗体阴阳性临界值为0.432,表明初步建立了检测Cp血清抗体的间接ELISA方法。利用该ELISA方法检测Cp、山羊痘病毒、羊支原体、结核分枝杆菌、副结核分枝杆菌、小反刍兽疫病毒、羊布鲁氏菌的阳性血清,结果显示,除Cp外其余病原的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将Cp阳性血清2倍倍比稀释后利用该ELISA方法检测,结果显示,该方法对阳性血清的检测限为稀释度1:640,该方法敏感性较高。利用5份Cp阳性血清和3份Cp阴性血清进行重复性试验,结果显示,该ELISA方法批内、批间重复性试验的最大变异系数分别为5.53%和7.79%,重复性较好。利用该ELISA方法和菌体凝集抑制试验对50份临床血清样品检测,结果显示,二者的阳性符合率为88.9%,阴性符合率为88.5%,总符合率为88.7%。进一步利用该ELISA方法对451份黑龙江省部分地区羊场的血清样品检测,结果显示,Cp抗体阳性率为51%(230/451),表明黑龙江省部分地区羊场导致羊干酪性淋巴结炎(CLA)的Cp感染率较高。本研究建立的间接ELISA方法为Cp血清抗体的检测提供了候选的技术手段,为Cp感染的早期检测和流行病学研究提供了有力技术支撑。
关键词
结核棒状杆菌
磷脂酶D
间接ELISA
抗体检测
Keywords
Corynebacterium pseudotuberculosis
phospholipase D
indirect ELISA
antibody detection
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
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作者
出处
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1
伪结核棒状杆菌磷脂酶D蛋白的表达及间接ELISA方法的建立与应用
白婕妤
孙婧
黄宇璇
王聚涛
杜金鑫
夏利宁
张万江
李刚
《中国预防兽医学报》
北大核心
2025
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