TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达 被引量：13

1

作者 丁劲 刘军 +2 位作者 薛采芳 李英辉 宫卫东 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期49-51,共3页

目的:构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法:将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV... 目的:构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain,PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease,TR)融合蛋白的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达。方法:将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein,HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因,克隆人含PTD TAT的pTAT原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果:成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体,并在IPTG诱导下获得特异性表达。结论:Tat-乙肝病毒 靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建,为体内应用靶向核酸酶治 疗乙型肝炎奠定了基础。 展开更多

关键词 TAT-乙肝病毒 靶向核糖核酸酶 融合蛋白 原核载体 构建

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基质金属蛋白酶-7在卵巢浆液性肿瘤中的表达 被引量：15

2

作者 郭颖 刘军 +1 位作者 吴静 张建国 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期471-473,共3页

目的　探讨MMP 7在卵巢浆液性肿瘤中的表达情况。方法　采用免疫组化SP法对 6例正常卵巢、12例卵巢浆液性囊腺瘤、6例交界性囊腺瘤及 2 2例卵巢浆液性囊腺癌MMP 7的表达进行了研究。结果　正常卵巢不表达MMP 7。大部分卵巢浆液性肿瘤的... 目的　探讨MMP 7在卵巢浆液性肿瘤中的表达情况。方法　采用免疫组化SP法对 6例正常卵巢、12例卵巢浆液性囊腺瘤、6例交界性囊腺瘤及 2 2例卵巢浆液性囊腺癌MMP 7的表达进行了研究。结果　正常卵巢不表达MMP 7。大部分卵巢浆液性肿瘤的胞浆及间质中都有MMP 7的阳性表达。MMP 7在卵巢良性、恶性及交界性浆液性肿瘤胞浆中的表达无明显差异 ;而在肿瘤间质中 ,恶性及交界性卵巢浆液性肿瘤中的表达远高于良性肿瘤 (P <0 .0 5 )。在交界性及恶性浆液性卵巢肿瘤中 ,部分肿瘤细胞的细胞核中也有MMP 7的表达 ,为国内外首次报道。结论　MMP 展开更多

关键词 卵巢浆液性肿瘤 表达 基质金属蛋白酶-7 免疫组织化学染色 卵巢肿瘤

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人端粒酶催化亚单位mRNA的实时荧光RT-PCR定量检测 被引量：7

3

作者 郭颖 刘军 +2 位作者 薛采芳 吴静 宋天保 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期618-620,共3页

目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定... 目的 :建立可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。方法 :用Trizol 试剂从HepG2细胞中分离总RNA ,然后反转录为cDNA。利用一对基因特异引物和一条TaqManMGB探针 ,以实时荧光PCR定量hTERT的cDNA。同时定量测定人 β 肌动蛋白 (hBA)的mRNA作为内对照。用梯度稀释的克隆的人 β 肌动蛋白基因制作标准曲线。结果 :标准曲线的相关系数为 1.0 0。实时荧光反转录PCR方法的平均变异系数为 7.1%。HepG2细胞hTERTmRNA与hBAmRNA的比值为 (1.3± 0 .3)× 10 -4。结论 :建立了可定量测定人端粒酶催化亚单位 (hTERT)mRNA的实时荧光反转录PCR方法。 展开更多

关键词 RNA 端粒酶催化亚单位 实时荧光PCR 反转录PCR HepG2细胞 定量测定 Β-肌动蛋白 BA 稀释 特异引物

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HBV靶向核糖核酸酶基因的原核表达和纯化及多克隆抗体的制备 被引量：8

4

作者 李英辉 刘军 +3 位作者 赵亚 薛采芳 丁劲 黄豫晓 《医学研究生学报》 CAS 2005年第4期295-297,301,共4页

目的:旨在获得HBV靶向核糖核酸酶,并制备其兔的多克隆抗体。方法:将构建好的HBV靶向核糖核酸酶基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达并经Ni2+亲和层析纯化。通过SDS PAGE和West... 目的:旨在获得HBV靶向核糖核酸酶,并制备其兔的多克隆抗体。方法:将构建好的HBV靶向核糖核酸酶基因克隆入原核表达载体pET32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导6×His融合蛋白的表达并经Ni2+亲和层析纯化。通过SDS PAGE和Westernblot鉴定后,用纯化的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体,并以复性的蛋白作为抗原,用ELISA测定抗体的效价。结果:成功地纯化和复性了HBV靶向核糖核酸酶,获得了较高效价的抗血清。结论:获得纯化并复性的HBV靶向核糖核酸酶和多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。 展开更多

关键词 HBV靶向核糖核酸酶 原核表达 多克隆抗体

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HBV靶向核糖核酸酶真核表达载体的构建及其在2.2.15细胞内的表达 被引量：9

5

作者 李英辉 刘军 薛采芳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期217-220,共4页

目的　构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)与乙肝病毒核心蛋白 (HBVc)的融合真核表达载体(该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶 ) ,抑制乙肝病毒在细胞内的复制。方法　分别从HL 6 0细胞和 2 2 15细胞中提取总RNA ,用RT PCR特异... 目的　构建人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN)与乙肝病毒核心蛋白 (HBVc)的融合真核表达载体(该融合蛋白即为构建的靶向核糖核酸酶 ) ,抑制乙肝病毒在细胞内的复制。方法　分别从HL 6 0细胞和 2 2 15细胞中提取总RNA ,用RT PCR特异性扩增hEDN及HBVc编码基因 ,将hEDN和HBVc克隆入真核表达载体pcDNA3 1(- ) ,hEDN克隆入原核表达载体 pGEX4T 1,并以纯化的原核表达产物免疫Balb/c小鼠 ,制备特异性抗体。用免疫荧光法检验 pcDNA3 1(- ) /HBVc -hEDN在转染 2 2 15细胞内地表达。结果　成功地构建了hEDN和HBVc的真核融合表达载体 ,并在 2 2 15细胞中较高效地表达。结论　pcDNA3 1(- ) /HBVc hEDN的构建和在 2 2 15细胞内的表达 。 展开更多

关键词 靶向核糖核酸酶 乙肝病毒 真核表达

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以恶性疟原虫MSP1和AMA1疫苗组合免疫小鼠诱导保护性免疫 被引量：3

6

作者 李淑梅 李珣 +2 位作者 缪军 刘忠湘 薛采芳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期936-940,共5页

目的以MSP1和AMA1的DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗组合免疫小鼠,诱导针对疟疾红内期抗原MSP1和AMA1的保护性抗体。方法将编码恶性疟原虫MSP1全片段和AMA1胞外域的DNA免疫质粒(VR1020/190.3和VR1020/E)、痘苗病毒载体(rMVA/19... 目的以MSP1和AMA1的DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗组合免疫小鼠,诱导针对疟疾红内期抗原MSP1和AMA1的保护性抗体。方法将编码恶性疟原虫MSP1全片段和AMA1胞外域的DNA免疫质粒(VR1020/190.3和VR1020/E)、痘苗病毒载体(rMVA/190.3和rMVA/E)及重组蛋白(d-GX190H和E)的同种类型疫苗混合,作为核酸疫苗(D)、病毒疫苗(V)及蛋白疫苗(P)按照“初始-强化”策略免疫小鼠。间接ELISA测血清中抗MSP1和AMA1抗体;用免疫血清进行体外原虫入侵红细胞抑制实验;由转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19和P.bANKA株分别对免疫鼠进行体内攻击。结果各组免疫血清中均产生了较强的抗体应答,抗MSP1抗体与抗AMA1抗体滴度的变化趋势一致。实验组免疫小鼠血清在体外对两株原虫入侵红细胞均有较大程度的抑制。体内攻击实验中实验组小鼠平均存活时间较对照组略长。结论采用以MSP1和AMA1为基础的DNA、重组痘苗病毒和重组蛋白疫苗的组合免疫小鼠能诱导出有效的保护性抗体。以上结果为疟疾红内期疫苗合理免疫方案提供了重要的实验依据。 展开更多

关键词 恶性疟原虫 裂殖子表面抗原1(MSP-1) 顶端膜抗原1(AMA-1) 疫苗 免疫

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Tat-p53融合蛋白的表达、纯化及其转导活性 被引量：2

7

作者 丁劲 刘军 +4 位作者 黄豫晓 李英辉 陈俊 赵亚 薛采芳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期587-590,共4页

目的:原核表达野生型p53与TatPTD(proteintransductiondomain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(D... 目的:原核表达野生型p53与TatPTD(proteintransductiondomain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白,制备p53特异的抗血清,证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内。结论:Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础。 展开更多

关键词 TAT p53 蛋白转导域 肿瘤 融合蛋白 活性分析 野生型P53基因 纯化 HepG2细胞 原核表达载体

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rhBMP-2m对化疗损伤小鼠的修复治疗作用 被引量：2

8

作者 刘斌 袁诚君 +1 位作者 田琼 薛采芳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期150-152,共3页

目的 :探讨重组人骨形成蛋白 2 (rhBMP 2m)对环磷酰胺 (CTX)致骨髓损伤小鼠的治疗作用。方法 :18只小鼠随机分为 3组 :即CTX注射组、BMP治疗组和PBS对照组 ,每组 6只小鼠。CTX组和BMP治疗组小鼠 ,一次性腹腔注射 2 0 0mg/kgCTX建立骨... 目的 :探讨重组人骨形成蛋白 2 (rhBMP 2m)对环磷酰胺 (CTX)致骨髓损伤小鼠的治疗作用。方法 :18只小鼠随机分为 3组 :即CTX注射组、BMP治疗组和PBS对照组 ,每组 6只小鼠。CTX组和BMP治疗组小鼠 ,一次性腹腔注射 2 0 0mg/kgCTX建立骨髓损伤的模型。注射CTX第 2天 ,BMP治疗组每只小鼠腹腔注射 0 .5mg的rhBMP 2m开始治疗。观察 3组小鼠外周血白细胞数的变化。分别在第 5天和第 8天 ,用流式细胞仪 (FCM )检测骨髓有核细胞中DNA的含量及细胞周期的变化 ,同时进行粒单细胞集落形成 (CFU GM)细胞培养。结果 :注射CTX后第 4天 ,BMP治疗组和CTX注射组的外周血白细胞数均降至最低点 ,然后逐渐回升 ,两组相比较无显著差异 (P >0 .0 5 )。注射CTX后第 5天 ,BMP治疗组骨髓有核细胞中 ,G0 /G1期细胞的比例较CTX组明显提高 ,细胞的坏死及凋亡率明显下降 (P <0 .0 1)。第 8天 ,BMP治疗组的骨髓有核细胞数较CTX组增加明显 (P <0 .0 1)。结论 展开更多

关键词 重组人骨形成蛋白-2 化学疗法 环磷酰胺 骨髓损伤 造血干细胞 动物实验

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通过序列分析筛选单纯疱疹病毒I型蛋白组中的PACS-1结合蛋白 被引量：1

9

作者 刘军 李英辉 +5 位作者 薛采芳 甄荣芬 李旬 王宪锋 刘忠湘 万磊 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第2期123-125,共3页

目的筛选单纯疱疹病毒I型蛋白组中的PACS1结合蛋白。方法根据筛选标准,利用ScanProsite和PSORT软件对蛋白质进行分析,并结合相关文献中的实验数据对分析结果进行校正。结果该方法可有效地筛选出PACS1结合蛋白。利用该方法,在单纯疱... 目的筛选单纯疱疹病毒I型蛋白组中的PACS1结合蛋白。方法根据筛选标准,利用ScanProsite和PSORT软件对蛋白质进行分析,并结合相关文献中的实验数据对分析结果进行校正。结果该方法可有效地筛选出PACS1结合蛋白。利用该方法,在单纯疱疹病毒I型蛋白组中,共筛选出可能与PACS1结合的蛋白质33种。结论建立了一种有效的筛选PACS1结合蛋白的方法。筛选出的单纯疱疹病毒I型的PACS1结合蛋白,将为研究PACS1在疱疹病毒发生及潜伏性感染中的作用提供指导。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒Ⅰ型 PACS-1 蛋白组 序列分析 生物信息学 筛选

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伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子在红内期的表达 被引量：1

10

作者 陈俊 刘忠湘 +4 位作者 赵亚 雷俊川 李淑梅 李珣 薛采芳 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期738-740,共3页

目的制备小鼠抗伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子(PbMIF)的抗体,并检测PbMIF在伯氏疟原虫红内期的表达。方法用纯化的PbMIF蛋白免疫BABL/c小鼠,制备小鼠抗PbMIF的抗血清。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体的效价,用免疫印迹(Western ... 目的制备小鼠抗伯氏疟原虫类巨噬细胞移动抑制因子(PbMIF)的抗体,并检测PbMIF在伯氏疟原虫红内期的表达。方法用纯化的PbMIF蛋白免疫BABL/c小鼠,制备小鼠抗PbMIF的抗血清。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体的效价,用免疫印迹(Western blotting)-二氨基联苯胺(DAB)底物显色法检测抗体的特异性。采用免疫印迹增强化学发光(ECL)的方法,用上述制备的抗血清检测PbMIF在红内期伯氏疟原虫的表达情况。结果ELISA测得小鼠抗PbMIF抗体的效价>1∶106,Western blotting显示该抗体可与原核表达的PbMIF蛋白特异性结合。ECL结果表明感染的红细胞中存在PbMIF。结论成功制备了小鼠抗PbMIF的抗体。红内期伯氏疟原虫表达PbMIF。 展开更多

关键词 伯氏疟原虫 巨噬细胞移动抑制因子 多克隆抗体 免疫印迹

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HIV-1 pol抗原HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位预测及改造分析 被引量：1

11

作者 黄豫晓 李英辉 +4 位作者 赵亚 韩荣霞 刘忠湘 毛张翔 薛采芳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期322-324,共3页

目的:初步筛选HIV-1pol抗原的HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,预测并初步鉴定修饰后的表位与HLA-A*0201之间亲和性的变化。方法:采用超基序、蛋白酶解、HLA结合力等预测相结合的办法筛选HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,通过氨基酸... 目的:初步筛选HIV-1pol抗原的HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,预测并初步鉴定修饰后的表位与HLA-A*0201之间亲和性的变化。方法:采用超基序、蛋白酶解、HLA结合力等预测相结合的办法筛选HLA-A*0201限制性低亲和性CTL表位,通过氨基酸置换适当修饰,并以T2细胞检测HLA-A*0201分子与肽的亲和力和稳定性来评价修饰后表位。结果:筛选出的低亲和性CTL候选表位,经修饰后与HLA-A*0201之间的亲和性均有不同程度的提高。其中,YVSLSFPQI(pol52-60Y1),YVSQIIEQL(pol673-681Y1),YIQKETWEA(pol548-556Y1)HLA-A*0201呈高亲和力结合,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(Dissociation Complex50,DC50)均大于8h。结论:预测的pol抗原表位经过修饰可能会成为潜在的HLA-A*0201限制性表位。 展开更多

关键词 HIV-1 CTL 表位

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我国YN株恶性疟原虫红内期瞬时转染系统的初步建立 被引量：3

12

作者 王宪锋 穆士杰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第5期447-449,共3页

目的 建立我国ＹＮ株恶性疟原虫（Ｐ．ｆ）红内期瞬时转染系统。方法 将含有不同长度片段ＧＢＰ１３０启动子的质粒，采用电穿孔法转染入环状体Ｐ．ｆ，以液体闪烁计数法检测各质粒中报告基因ＣＡＴ的表达。结果 各质粒中启动子的表... 目的 建立我国ＹＮ株恶性疟原虫（Ｐ．ｆ）红内期瞬时转染系统。方法 将含有不同长度片段ＧＢＰ１３０启动子的质粒，采用电穿孔法转染入环状体Ｐ．ｆ，以液体闪烁计数法检测各质粒中报告基因ＣＡＴ的表达。结果 各质粒中启动子的表达强度有差异，表明转染Ｐ．ｆ获得成功。结论 首次建立了我国ＹＮ株Ｐ．ｆ的瞬时转染系统，为进一步研究Ｐ．ｆ的基因表达调控和基因功能奠定了基础。 展开更多

关键词 恶性疟原虫 瞬时转染系统 红内期

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单纯疱疹病毒Ⅰ型糖蛋白B胞浆区编码基因的原核表达、纯化及抗体制备

13

作者 李英辉 刘军 +5 位作者 薛采芳 甄荣芬 李旬 王宪锋 刘忠湘 万磊 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期549-551,共3页

目的获得高纯度的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1糖蛋白BgB胞浆区蛋白并制备其特异性抗体。方法从感染HSV-1的BHK细胞中提取总RNA用RT-PCR特异性扩增HSV-1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆入表达载体pGEX4T-1中,进行融合表达... 目的获得高纯度的重组单纯疱疹病毒Ⅰ型HSV-1糖蛋白BgB胞浆区蛋白并制备其特异性抗体。方法从感染HSV-1的BHK细胞中提取总RNA用RT-PCR特异性扩增HSV-1gB胞浆区编码基因,经双酶切后,克隆入表达载体pGEX4T-1中,进行融合表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备抗体,进行Westernblot鉴定。结果用IPTG诱导后,表达出相对分子质量Mr约42000的融合蛋白。用纯化的融合蛋白免疫小鼠制备的抗体滴度为1400。结论获得重组HSV-1gB胞浆区蛋白及其特异性抗体,为后续功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 单纯疱疹病毒I型 糖蛋白B 原核表达 谷胱甘肽巯基-转移酶 纯化 抗体

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腺病毒介导的靶向核糖核酸酶抑制HBV复制的研究

14

作者 宫卫东 李鹏 +2 位作者 赵亚 刘军 薛采芳 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期279-283,共5页

目的观察Linker介导的乙型肝炎靶向核糖核酸酶(HBV-TRL)重组腺病毒载体(RAd)对HBV复制的抑制作用。方法使用构建载体pcDNA3.1(-)/TRL、TR、TRmut、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBVc)、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN),分别将各目的片段亚... 目的观察Linker介导的乙型肝炎靶向核糖核酸酶(HBV-TRL)重组腺病毒载体(RAd)对HBV复制的抑制作用。方法使用构建载体pcDNA3.1(-)/TRL、TR、TRmut、乙型肝炎病毒核心蛋白(HBVc)、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(hEDN),分别将各目的片段亚克隆入穿梭质粒pDC316,与辅助质粒用磷酸钙法共转染HEK293细胞,分别产生载体RAd/TRL、RAd/TR、RAd/TRmut、RAd/HBVc、RAd/hEDN,其中RAd/TRL组为实验组,其余为对照组。感染HepG2.2.15细胞,应用RT-PCR、间接免疫荧光法检测TRL的表达,放免法测定细胞上清中HBsAg、HBeAg的含量。结果成功获得了含TRL、TR、HBVc、hEDN等不同目的片段的RAd,在HepG2.2.15细胞中得到有效表达,并且明显降低了细胞上清中HBsAg、HBeAg的含量。结论腺病毒载体介导的乙肝靶向核糖核酸酶具有明显的抑制HBV复制的作用。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 核衣壳导向的病毒灭活 靶向核糖核酸酶 腺病毒载体

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四环素调控的小鼠LAIR-1/CD305转基因小鼠的初步建立

15

作者 方亮 缪军 +5 位作者 韩卫宁 张圆 张瑞中 张新海 庄然 金伯泉 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第3期199-201,207,共4页

目的建立四环素调控的小鼠LAIR-1/CD305转基因小鼠,为进一步研究mLAIR-1分子的体内功能奠定基础。方法构建pBI-5-mLAIR-1载体,显微注入B6D1F1受精卵,PCR检测新生小鼠基因组DNA中LAIR-1与荧光素酶(Lucifer-ase)基因。将mLAIR-1和荧光素... 目的建立四环素调控的小鼠LAIR-1/CD305转基因小鼠,为进一步研究mLAIR-1分子的体内功能奠定基础。方法构建pBI-5-mLAIR-1载体,显微注入B6D1F1受精卵,PCR检测新生小鼠基因组DNA中LAIR-1与荧光素酶(Lucifer-ase)基因。将mLAIR-1和荧光素酶双阳性小鼠耳成纤维细胞转染含rtTA的pUHD17.1质粒,用含盐酸强力霉素(Dox)的培养基进行培养,检测细胞裂解液中荧光素酶活性。将荧光素酶表达依赖Dox小鼠与C57BL/6交配,采用PCR对子代鼠进行检测。结果共获得9只首建鼠,其目的基因表达高度依赖Dox,并得到其中5只首建鼠的F1代小鼠。结论获得了四环素调控的小鼠LAIR-1转基因小鼠,可用于该分子体内功能的研究。 展开更多

关键词 小鼠LAIR-1 转基因小鼠 四环素调控表达系统

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应用四环素调控系统建立可调控抗恶性疟原虫DNA疫苗的初步研究

16

作者 雷俊川 缪军 +3 位作者 李珣 Kai Schonig Hermann Bujard 薛采芳 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期356-359,共4页

目的 :应用四环素 (tetracycline,Tet)可调控系统建立可调控的抗恶性疟原虫的DNA疫苗。方法 :首先构建恶性疟原虫顶端膜抗原 1(AMA 1)基因和转录激活因子 (tTA或rtTA)基因的真核表达质粒pTL 8/AMA 1和pTL 8/AMA 1(rtTA) ,并大量制备这... 目的 :应用四环素 (tetracycline,Tet)可调控系统建立可调控的抗恶性疟原虫的DNA疫苗。方法 :首先构建恶性疟原虫顶端膜抗原 1(AMA 1)基因和转录激活因子 (tTA或rtTA)基因的真核表达质粒pTL 8/AMA 1和pTL 8/AMA 1(rtTA) ,并大量制备这两种质粒及表达转录抑制子 (tTS)的质粒pUHS6 1。以pTL 8/AMA 1、pTL 8/AMA 1(rtTA)和pTL 8/AMA 1(rtTA)加pUHS6 1/tTS免疫小鼠后 ,用四环素类似物强力霉素 (doxcycline ,dox)诱导或抑制上述DNA载体内AMA 1的表达 ,并分离小鼠血清检测针对AMA 1抗体的表达情况。结果 :①构建了真核表达质粒pTL 8/AMA 1和pTL 8/AMA 1(rtTA) ;②pTL 8/AMA 1和pTL 8/AMA 1(rtTA)在没有被诱导表达时 (仅基础表达 ) ,可诱导明显的免疫应答。在以pTL 8/AMA 1(rtTA)与含tTS的pUHS6 1共同免疫后 ,可极大地降低其免疫应答。应用dox诱导pTL 8/AMA 1(rtTA)中的AMA 1基因表达后 ,可明显引起免疫应答。结论 :pTL 8/AMA 1(rtTA)附加pUHS6 1构成了可调节的DNA免疫系统。该系统的建立将对进一步深入研究DNA疫苗的免疫机制和调控基因表达 。 展开更多

关键词 四环素可调控系统 DNA疫苗 顶端膜抗原1

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HIV—1复合多表位基因的原核表达和多克隆抗体制备

17

作者 李英辉 赵亚 +3 位作者 刘忠湘 毛张翔 黄豫晓 薛采芳 《科学技术与工程》 2008年第12期3119-3123,共5页

为表达HIV—1复合多表位基因并制备其多克隆抗体。设计引物,以HIV—1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌。将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET... 为表达HIV—1复合多表位基因并制备其多克隆抗体。设计引物,以HIV—1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入大肠杆菌。将测序正确的p24MEG基因克隆入原核表达载体pET32a并诱导表达。采用Ni2+-NTA亲和柱纯化目的蛋白,以p24抗体对纯化蛋白进行Western-blot分析。将纯化的融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。通过PCR成功获得长度为651bp的HIV—1的p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG基因,通过诱导表达,显示在相对分子量约45000处有预计大小的特异性条带,表明成功表达出融合蛋白。经此纯化的融合蛋白免疫的家兔能产生特异性抗体,其滴度达到1∶3200。纯化的融合蛋白和多克隆抗体为研究新型HIV疫苗奠定一定的理论和实践基础。 展开更多

关键词 HIV—1 复合多表位基因 原核表达 多克隆抗体

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重组大鼠胰岛素样生长因子-1聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物缓释微球对2型糖尿病GK大鼠种植体周围骨形成的影响 被引量：3

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作者 于淼 惠新民 +3 位作者 王峰 张宁 张和鹏 宋应亮 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期260-264,361,共6页

目的评估重组大鼠胰岛素样生长因子-1(rrIGF-1)聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)缓释微球对2型糖尿病GK大鼠种植体周围骨形成的影响。方法将20只雄性GK大鼠进行糖尿病造模成功后随机分为2组,分别给予加载包裹rrIGF-1的PLGA缓释微球(治疗组... 目的评估重组大鼠胰岛素样生长因子-1(rrIGF-1)聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(PLGA)缓释微球对2型糖尿病GK大鼠种植体周围骨形成的影响。方法将20只雄性GK大鼠进行糖尿病造模成功后随机分为2组,分别给予加载包裹rrIGF-1的PLGA缓释微球(治疗组,n=10)和加载包裹与rrIGF-1等量安慰剂的PLGA缓释微球(糖尿病组,n=10)处理,再以10只未做处理的SD大鼠作为对照组。在所有大鼠胫骨内植入种植体,治疗组和糖尿病组大鼠同时分别加载等量相应种类的PLGA缓释微球。术后4、5、8周在种植体周围局部采血,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清骨钙素(OCN)、骨特异性碱性磷酸酶(B-ALP)及I型前胶原羧基前肽(PICP)含量。结果种植体植入术后4周,糖尿病组和治疗组的血清OCN、B-ALP和PICP水平均明显低于对照组(P均<0.05);术后5周,糖尿病组的OCN和B-ALP水平明显低于对照组和治疗组(P均<0.05),糖尿病组和治疗组的PICP水平也均明显低于对照组(P<0.05),治疗组的OCN水平明显高于术后4周(P<0.05),对照组的PICP水平则明显低于术后4周(P<0.05);术后8周,糖尿病组大鼠的OCN和B-ALP水平明显低于对照组和治疗组(P均<0.05),糖尿病组和治疗组大鼠的血清PICP水平均明显低于对照组(P均<0.05)。结论 rrIGF-1 PLGA缓释微球局部加载可促进GK大鼠种植体周围骨形成。 展开更多

关键词 重组大鼠胰岛素样生长因子-1 聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物 2型糖尿病 GK大鼠 骨钙素 骨特异性碱性磷酸酶 Ⅰ型前胶原羧基前肽

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天然溶瘤新城疫病毒Italien株HN基因真核表达载体的构建和表达 被引量：1

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作者 张华 边惠洁 +3 位作者 尉丁 李亚琳 杨滨 陈志南 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期100-103,共4页

目的构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达。方法采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HNcDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆。用Weste... 目的构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达。方法采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HNcDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆。用Westernblot、免疫荧光法检测HN蛋白的表达。结果经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实真核表达载体pcDNA3.1-HN构建正确。Westernblot和免疫荧光分析表明HN基因在CHO-K1中成功表达。结论天然溶瘤型NDVItalien株的HNcDNA被成功克隆,所构建的真核表达载体pcDNA3.1-HN可以在CHO-K1细胞中稳定表达。 展开更多

关键词 新城疫病毒 血凝素-神经氨酸酶基因 转染 基因表达

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表达HIV-1复合多表位基因的p815细胞稳定株的建立和评价

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作者 张宁 李英辉 +4 位作者 赵亚 刘忠湘 毛张翔 黄豫晓 薛采芳 《科学技术与工程》 2009年第2期253-256,共4页

建立稳定表达HIV-1p24MEG复合多表位基因的p815细胞克隆。设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入pcDNA3.1(+)。在阳离子聚合物作用下重组真核质粒... 建立稳定表达HIV-1p24MEG复合多表位基因的p815细胞克隆。设计引物,以HIV-1标准株全长cDNA序列为模板,PCR扩增获得p24基因片段;合成改造后的多个表位基因MEG并且与p24片段相连接,克隆入pcDNA3.1(+)。在阳离子聚合物作用下重组真核质粒转染的p815(H-2d)细胞,以G418压力筛选,RT-PCR检测mRNA表达,间接免疫荧光检测蛋白表达。通过PCR获得了HIV-1p24片段,获得了与多表位基因连接后的p24MEG融合基因,成功构建了p24MEG基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/p24MEG。转染p815细胞后,RT-PCR检测到融合蛋白mRNA表达,间接免疫荧光显示p815细胞内有融合蛋白的表达。结论:建立了稳定表达HIV-1p24MEG融合蛋白的p815细胞克隆,为评价多表位抗原p24MEG在BALB/c小鼠体内诱导的细胞免疫应答奠定基础。 展开更多

关键词 HIV-1 复合多表位基因 稳定株

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