柘木化学成分的研究 被引量：15

1

作者 缪春辉 顾正兵 杨根金 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期211-212,共2页

目的 :对柘木的化学成分进行了研究。方法 :采用硅胶柱层析和SephadexLH 2 0凝胶柱层析 ,分析了柘木 80 %乙醇提取物。结果 :从脂溶性部分分离到 6个化合物。结论 :化合物分别鉴定为丁香脂素 (Ⅰ ) ,五味子素 (Ⅱ ) ,gominsinA(Ⅲ ) ,go... 目的 :对柘木的化学成分进行了研究。方法 :采用硅胶柱层析和SephadexLH 2 0凝胶柱层析 ,分析了柘木 80 %乙醇提取物。结果 :从脂溶性部分分离到 6个化合物。结论 :化合物分别鉴定为丁香脂素 (Ⅰ ) ,五味子素 (Ⅱ ) ,gominsinA(Ⅲ ) ,gominsinH(Ⅳ ) ,β 谷甾醇 (V)和 β 胡萝卜甙 (Ⅵ )。其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。 展开更多

关键词 柘木 木脂素 五味子素 化学成分 中药 植物药

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一氧化氮对肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡作用的研究

2

作者 姚小鹏 王皓 +5 位作者 李强 钱卫珠 黄怡 白冲 董宇超 刘忠令 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第9期999-1002,共4页

目的 :研究一氧化氮 (NO)对肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖和凋亡的作用。方法 :通过非核素标记细胞增殖检测试剂盒、3 H- Td R掺入、形态学、流式细胞术等方法研究 NO与 PASMC增殖和凋亡的关系。 结果 :2 5～ 5 0 0μm ol/L的 NO供体 S... 目的 :研究一氧化氮 (NO)对肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)增殖和凋亡的作用。方法 :通过非核素标记细胞增殖检测试剂盒、3 H- Td R掺入、形态学、流式细胞术等方法研究 NO与 PASMC增殖和凋亡的关系。 结果 :2 5～ 5 0 0μm ol/L的 NO供体 S-亚硝基乙酰青霉胺 (SNAP)呈剂量依赖性地减少 PASMC的细胞数和 DNA合成 ,5 0 0μm ol/L的 SNAP显著减少 S期和G2 /M期的细胞比例 ,增加 G0 /G1 期的细胞比例。 10 0～ 5 0 0μmol/L的 SNAP呈剂量依赖性地增加 PASMC的凋亡率。结论 :NO可抑制 PASMC增殖并促进其凋亡。早期给予 展开更多

关键词 肺动脉高压 一氧化氮 肺动脉 平滑肌 细胞增殖 细胞凋亡

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pGFP-FL质粒的构建及其在FL基因修饰性肿瘤疫苗中的应用 被引量：1

3

作者 卢洋 钱卫珠 +3 位作者 王皓 吴孟超 郭亚军 薛琪 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第7期592-595,共4页

目的　构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法　利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒。在该质粒中,以... 目的　构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法　利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒。在该质粒中,以CMV启动子驱动FL基因,同时以肽链延长因子（EF-1α）启动子驱动GFP基因,并引入原核和真核选择基因KanR/neo。对所获得的pGFP-FL质粒以限制性内切酶酶切鉴定后,再将其导入Hepa1-6细胞内,直接在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况,同时以RT-PCR和PCR产物测序的方法对GFP阳性细胞内FL基因的表达进行检测。结果　质粒的酶切鉴定结果表明所构建的pGFP-FL与预期的结构一致,FL和GFP两者能同时在Hepa1-6细胞内表达。结论　本研究构建了一种新型的FL基因修饰肿瘤疫苗研究载体,位于该载体上的GFP的表达能够反映FL基因的转录表达情况,可以作为FL基因表达的报告基因。 展开更多

关键词 FL基因 肿瘤疫苗 分子生物学 质粒载体 pGFP-FL质粒

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高效转染人T细胞的逆转录病毒载体系统的构建及应用 被引量：4

4

作者 张瑞萍 云琳 +4 位作者 彭玲 陆斌 周倩 王皓 郭亚军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期420-422,426,共4页

目的：构建能高效转染人T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统，并与传统的逆转录病毒载体系统做比较。方法：首先在原载体pCMMP-EGFP的基础上，构建携带内部核糖体进入位点（IRES）基因的逆转录病毒载体pCMMP-IRES-GFP。将嵌合... 目的：构建能高效转染人T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统，并与传统的逆转录病毒载体系统做比较。方法：首先在原载体pCMMP-EGFP的基础上，构建携带内部核糖体进入位点（IRES）基因的逆转录病毒载体pCMMP-IRES-GFP。将嵌合T细胞受体基因插入该载体中，与另外两个辅助载体pMD．MLVgag．pol和pHDM．G共同转染包装细胞293T。48h后收培养上清，高速离心病毒。同时将嵌合T细胞受体基因插入传统的逆转录病毒载体pLXSN中，并转染包装细胞PA317，用G418加压筛选出转染的PA317细胞克隆。扩大培养48h后，收细胞培养上清即为病毒液，分别用上述两种方法得到的病，譬液感染NIH333细胞，检测病毒的滴度。取适量病毒液感染川PHA激活后的人原代T细胞，48h后在荧光显微镜下观察绿色荧光，并用流式细胞术（FCM）检测病毒感染的效率。结果：成功地构建逆转录病毒载体pCMMP—IRES-GFP。将目的基因插入该载体中，与pMD．MLVgag．pol和pHDM．G共同转染包装细胞293T。培养48h后，离心收获浓缩的上清中含有滴度为2．15×10^11VP／L的病毒。以其感染用PHA激活后的人原代T细胞48h后，在荧光显微镜下能观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达。FCM检测病毒对T细胞的感染效率为50％～60％，并可用FCM进行分选。而用pLXSN载体转染的PA317细胞，包装得到的病毒滴度为6．43×10^9VP／L，病毒感染T细胞的效率仅为5％～10％。结论：构建了能高效转染T细胞并带有快速筛选标签的逆转录病毒载体系统，为T细胞的基础与临床研究打下了基础。 展开更多

关键词 逆转录病毒载体 T细胞 内部核糖体进入位点

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钾通道阻断剂和一氧化氮对肺动脉平滑肌细胞钾电流的作用 被引量：2

5

作者 姚小鹏 钱卫珠 +5 位作者 李强 朱海峰 黄怡 白冲 董宇超 刘忠令 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期192-195,共4页

目的 :研究钾通道阻断剂、一氧化氮 (NO)对继代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)钾电流 (IK)的作用。 方法 :使用全细胞膜片钳技术观察继代培养大鼠 PASMC IK 及钾通道阻断剂格列本脲 (Gli) ,四乙胺 (TEA) ,4 -氨基吡啶 (4- AP)和 NO供... 目的 :研究钾通道阻断剂、一氧化氮 (NO)对继代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)钾电流 (IK)的作用。 方法 :使用全细胞膜片钳技术观察继代培养大鼠 PASMC IK 及钾通道阻断剂格列本脲 (Gli) ,四乙胺 (TEA) ,4 -氨基吡啶 (4- AP)和 NO供体 S-亚硝基乙酰青霉胺 (SNAP)对其的作用。 结果 :继代培养大鼠 PASMC较急性分离者之 IK 明显降低。 4 - AP和高浓度TEA显著降低继代培养大鼠 PASMC之 IK,SNAP显著增加继代培养大鼠 PASMC之 IK。结论 :继代培养大鼠 PASMC钾通道特性发生改变 ,但通道阻断剂和 NO仍能显著改变其活性。 展开更多

关键词 肺动脉 平滑肌细胞 钾通道 一氧化氮 膜片钳

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人CTLA4单克隆抗体的制备和鉴定 被引量：1

6

作者 卢洋 钱卫珠 +2 位作者 王皓 吴孟超 郭亚军 《医学研究生学报》 CAS 2002年第2期98-101,共4页

目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。　方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印... 目的 :制备人的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原 4 (CTLA4 )的单克隆抗体。　方法 :利用蛋白纯化技术获得人CTLA4Ig蛋白免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞NS1融合 ,用ELISA法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,并用Western印迹和流式细胞检测仪鉴定所制备的单克隆抗体。　结果 :获得一个稳定的分泌抗人CTLA4的杂交瘤细胞株。该细胞克隆培养上清中所含的单抗能和经过PHA刺激后的人T细胞结合 ,但不能和经过PHA刺激后的小鼠T细胞结合。　结论 :利用重组人CTLA4Ig制备获得高特异性的抗人CTLA4单克隆抗体。 展开更多

关键词 CTLA4 单克隆抗体 T细胞免疫 制备 鉴定

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TRAIL及其5种受体DNA片段的扩增与序列分析

7

作者 季军捷 王华菁 +5 位作者 黑振宇 彭玲 王皓 李晓冬 时玉舫 郭亚军 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期213-214,217,共3页

目的制备TRAIL及其5种受体的特异性基因探针。方法以PHA刺激人外周血淋巴细胞(PBL)增殖,从而诱导TRAIL及其受体的mRNA转录水平提高,然后用RTPCR方法扩增出TRAIL及其5种受体的DNA基因片段,并采用基因测序法确证所得基因片段序列的正确性... 目的制备TRAIL及其5种受体的特异性基因探针。方法以PHA刺激人外周血淋巴细胞(PBL)增殖,从而诱导TRAIL及其受体的mRNA转录水平提高,然后用RTPCR方法扩增出TRAIL及其5种受体的DNA基因片段,并采用基因测序法确证所得基因片段序列的正确性。结果获得了TRAIL及其5种受体的DNA基因片段。结论所用方法正确,为研究TRAIL及其受体调控细胞凋亡的机制提供了有价值的工具。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 植物血凝素 凋亡 反转录聚合酶链反应

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肝癌中EPHA3受体SAM结构域缺失突变体的发现

8

作者 陈霞 厉建中 嵇承栋 《生物学杂志》 CAS CSCD 2017年第1期1-4,共4页

酪氨酸蛋白激酶受体(RTKs)具有调节细胞生长、分化和迁移的能力,是一类多功能的跨膜糖蛋白。EPH受体家族蛋白高度保守,成员众多,是RTKs中最大的一个分支。大量的研究表明,EPH家族蛋白不仅在胚胎发育过程中具有调节细胞间黏附或排斥、细... 酪氨酸蛋白激酶受体(RTKs)具有调节细胞生长、分化和迁移的能力,是一类多功能的跨膜糖蛋白。EPH受体家族蛋白高度保守,成员众多,是RTKs中最大的一个分支。大量的研究表明,EPH家族蛋白不仅在胚胎发育过程中具有调节细胞间黏附或排斥、细胞迁移、轴突导向以及血管形成等多方面作用,并且在一些恶性肿瘤的血管生成、肿瘤转移与侵袭等肿瘤的发生发展及预后过程中也发挥着重要的调节作用。在研究EPHA3受体对肝癌转移的作用过程中,发现Epha3在肝癌组织中具有一种新的突变体,该突变体在其胞内部分缺失了96 bp并提前终止翻译而缺少SAM结构域,推测其可能在肝癌的发生发展过程中起调控作用。 展开更多

关键词 EPHA3 突变 肿瘤 酪氨酸激酶受体

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人丙酮酸羧化酶异位表达提高中国仓鼠卵巢细胞补料分批培养后期活率 被引量：1

9

作者 付托 张存超 +3 位作者 靖钰 蒋成 张学光 寇庚 《化学与生物工程》 CAS 2013年第6期39-42,共4页

构建了人丙酮酸羧化酶(hPC)异位表达的重组CHO细胞,并检测了重组细胞生长情况的改变。利用分子生物学实验技术构建hPC-pcDNA 3.0表达载体,将其转染CHO-K1细胞;转染细胞经过G418抗性筛选后,通过荧光定量PCR检测目的基因表达,并挑选表达... 构建了人丙酮酸羧化酶(hPC)异位表达的重组CHO细胞,并检测了重组细胞生长情况的改变。利用分子生物学实验技术构建hPC-pcDNA 3.0表达载体,将其转染CHO-K1细胞;转染细胞经过G418抗性筛选后,通过荧光定量PCR检测目的基因表达,并挑选表达量最高的克隆进行补料分批培养。电泳及测序结果显示,构建的hPC-pcDNA3.0表达载体序列与预期一致;在mRNA水平鉴定目的基因显示,4#克隆的mRNA表达水平最高;选其进行补料分批培养,生长曲线显示在培养后期,其活细胞密度和细胞活率均高于对照。成功构建了细胞生长和活率改善的重组CHO细胞,获得了生长改善的细胞株,为后续的重组蛋白表达研究与细胞培养工艺优化奠定了基础。 展开更多

关键词 CHO细胞 丙酮酸羧化酶 补料分批培养 活率

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基因工程改造与中国仓鼠卵巢细胞凋亡 被引量：1

10

作者 张存超 寇庚 王皓 《化学与生物工程》 CAS 2014年第12期1-3,8,共4页

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是表达重组单克隆抗体常用的工程细胞。在细胞培养过程中,凋亡是限制重组蛋白产量提高的重要因素之一。对CHO细胞进行基因工程改造是抑制细胞凋亡的重要途径。主要从细胞凋亡信号途径、细胞信号通路以及microRNA... 中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是表达重组单克隆抗体常用的工程细胞。在细胞培养过程中,凋亡是限制重组蛋白产量提高的重要因素之一。对CHO细胞进行基因工程改造是抑制细胞凋亡的重要途径。主要从细胞凋亡信号途径、细胞信号通路以及microRNA等方面综述了运用基因工程手段对CHO细胞凋亡改造的进展,并探讨了潜在的基因工程靶点。 展开更多

关键词 凋亡 基因工程 MICRORNA 中国仓鼠卵巢细胞

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特异性人工抗原提呈细胞体外激活CD19嵌合抗原受体T细胞的构建

11

作者 彭耀军 吴其艳 +2 位作者 刘鸿宇 赵健 危华锋 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期581-587,共7页

目的构建CD19特异性人工抗原提呈细胞(aAPC)用于体外激活扩增CD19嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞(CD19-CAR-T),并考察其杀伤效应。方法通过慢病毒介导的方法制备以NIH3T3为细胞骨架、表达共刺激分子CD86和/或CD137L的CD19特异性a APC(NIH3T... 目的构建CD19特异性人工抗原提呈细胞(aAPC)用于体外激活扩增CD19嵌合抗原受体(CAR)修饰T细胞(CD19-CAR-T),并考察其杀伤效应。方法通过慢病毒介导的方法制备以NIH3T3为细胞骨架、表达共刺激分子CD86和/或CD137L的CD19特异性a APC(NIH3T3-CD19/86、NIH3T3-CD19/86/137L)。采用照射的CD19特异性a APC与CD19-CAR-T细胞按一定比例混合培养激活扩增CD19-CAR-T细胞,台盼蓝染色法检测并绘制CD19-CAR-T细胞生长曲线;流式细胞术检测CD19-CAR-T细胞CAR表达变化及分化表型;生物发光细胞毒性法检测扩增的CD19-CAR-T细胞体外靶特异杀伤效应。结果流式检测结果显示NIH3T3-CD19/86和NIH3T3-CD19/86/137L细胞表面分别高表达CD19、CD86和/或CD137L分子;NIH3T3-CD19/86和NIH3T3-CD19/86/137L细胞都能够高效扩增CD19-CAR-T细胞,NIH3T3-CD19/86/137L细胞具有更好的扩增效应,其与CD19-CAR-T细胞混合培养14 d后,扩增的T细胞数量明显高于NIH3T3-CD19/86细胞组(P<0.05);同时,与刺激前相比NIH3T3-CD19/86和NIH3T3-CD19/86/137L细胞刺激扩增的T细胞中CD19-CAR-T细胞比例显著增加(P<0.05);扩增的CD19-CAR-T细胞具有靶特异杀伤效应,能够特异性杀伤CD19阳性靶细胞;流式检测显示NIH3T3-CD19/86/137L扩增的CD19-CAR-T细胞含有约20%作用中心记忆性T细胞。结论成功制备CD19特异性a APC,其可在体外特异性扩增功能性CD19-CAR-T细胞,为初步建立制备高质量临床级CD19-CART细胞的方法提供了技术支撑。 展开更多

关键词 人工抗原提呈细胞 CD19 嵌合抗原受体修饰T细胞 增殖 杀伤

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重组内肽酶AspN的原核表达纯化和活性鉴定

12

作者 郑娟 郭怀祖 +5 位作者 李晶 段树燕 赵自叶 张大鹏 郭尚敬 王皓 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期186-192,共7页

蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶... 蛋白内肽酶AspN是一种锌金属内切肽酶,能选择性切割天冬氨酸的N端肽键,广泛应用于蛋白的多肽制备及质量肽图谱鉴定。目前内肽酶AspN来源于细菌分泌,产量低,制备困难,成本高,极大地限制了该酶的应用。将脑膜脓毒性黄杆菌分泌的蛋白内肽酶Asp N所对应的基因克隆入表达载体p ET32a,导入E.coli BL21(DE3),首次运用原核表达系统进行可溶性融合表达,亲和层析对重组蛋白进行纯化。用HPLC、SDS-PAGE和荧光底物Anthranilyl-Ala-Phe-Ala-Phe-Asp-Val-Phe(NO2)-Tyr-Asp对重组酶进行酶活鉴定。结果表明重组的内肽酶Asp N具有与标准品基本一致的酶切活性,能够较好地应用于生物和制药领域。 展开更多

关键词 重组内肽酶AspN 原核表达 纯化 活性鉴定

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hMDHⅡ过表达抑制过氧化氢压力下的CHO细胞凋亡

13

作者 靖钰 张存超 +3 位作者 付托 蒋成 张学光 寇庚 《化学与生物工程》 CAS 2014年第7期9-12,共4页

构建人苹果酸脱氢酶Ⅱ(hMDHⅡ)过表达的重组CHO细胞,并研究hMDHⅡ过表达对过氧化氢压力下CHO细胞凋亡的影响。结果显示,在0.1mmol·L-1过氧化氢压力下,hMDHⅡ过表达明显提高了补料分批培养后期细胞活率。线粒体膜电位及活性氧检测显... 构建人苹果酸脱氢酶Ⅱ(hMDHⅡ)过表达的重组CHO细胞,并研究hMDHⅡ过表达对过氧化氢压力下CHO细胞凋亡的影响。结果显示,在0.1mmol·L-1过氧化氢压力下,hMDHⅡ过表达明显提高了补料分批培养后期细胞活率。线粒体膜电位及活性氧检测显示,hMDHⅡ过表达后线粒体膜电位显著提高、活性氧显著降低,表明hMDHⅡ过表达抑制细胞凋亡可能是通过减少细胞内活性氧而实现的。 展开更多

关键词 CHO细胞 人苹果酸脱氢酶Ⅱ 补料分批培养 凋亡 活性氧

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激活型人源化抗人CD137单克隆抗体的研制与生物学活性鉴定

14

作者 何妍 王华菁 +3 位作者 陆婷 徐依云 黄勇 杨焕凤 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2018年第9期1332-1337,共6页

目的制备鼠抗人CD137抗体,并对该抗体进行人源化改造。方法构建h CD137-p CDNA3.4真核表达质粒,经293F细胞表达纯化及鉴定后,获得CD137蛋白。制备p HAGE-CMV-MCS-IRES-Zs Green-h CD137的慢病毒,感染HEK-293FT细胞,获得用来筛选杂交瘤的... 目的制备鼠抗人CD137抗体,并对该抗体进行人源化改造。方法构建h CD137-p CDNA3.4真核表达质粒,经293F细胞表达纯化及鉴定后,获得CD137蛋白。制备p HAGE-CMV-MCS-IRES-Zs Green-h CD137的慢病毒,感染HEK-293FT细胞,获得用来筛选杂交瘤的CD137转基因细胞株。将CD137蛋白免疫小鼠,检测小鼠血清抗体效价,将免疫小鼠的脾脏和骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用ELISA方法及流式细胞术对小鼠杂交瘤进行筛选。将筛选后的杂交瘤细胞接种小鼠,获得腹水。对抗体亚型和抗体效价进行测定,并通过竞争结合抑制实验等方法对所获的CD137单抗的生物学特性进行分析鉴定。提取该m Ab杂交瘤细胞株的总RNA逆转录成c DNA,进行鼠抗人CD137抗体可变区序列克隆,构建人源化抗体重链和轻链表达载体,瞬时转染HEK-293FT,检测分析各重组人源化抗体与抗原的亲和力。结果获得1株CD137单抗(6F5),该抗体与CD137L有竞争作用。蛋白结合表位在A.A 30-100。6F5能够激活NF-κB信号通路,对外周血单个核细胞增殖具有显著促进作用,且人源化后抗体的亲和力不变。结论成功制备1株CD137人源化抗体,该人源化抗体为下一步开展体内肿瘤治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 CD137 单克隆抗体 T细胞激活

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