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EGFP-CD40L融合基因的构建、表达及功能鉴定
被引量：
1
1
作者
马晶莹
谭晓华
+1 位作者
陈媛媛
邱实
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第12期1261-1266,共6页
目的构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells,DCs)表型和功能的影响。方法以RT-PCR方法从健康人外...
目的构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells,DCs)表型和功能的影响。方法以RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中克隆hecdCD40L基因片段。小鼠血管内皮细胞生长因子受体2信号肽序列(SigmKDR)和EGFP与hecdCD40L基因片段融合或不融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1SigmKDR-EGFP(sEGFP)和pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L。用脂质体将表达载体转染至体外培养的COS-7细胞后,G418抗性筛选,流式细胞仪分选并检测EGFP和/或CD40L的表达。Western blot检测融合蛋白在COS-7细胞及其上清中的表达,用镍柱和超滤离心管获取纯化浓缩的sEGFP-hecdCD40L和sEGFP融合蛋白与人DCs共孵育,流式细胞仪和ELISA分析DCs对2种融合蛋白的摄取率、DCs表型变化以及细胞因子IL-12的分泌。结果 pcDNA3.1sEGFP或pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L转染COS-7细胞后,经G418抗性筛选和流式细胞仪分选筛选获得高效表达融合蛋白的单克隆细胞株,EGFP阳性细胞可达95%以上,Westernblot在细胞内和上清中均能检测到融合蛋白。sEGFP或sEGFP-hecdCD40L与DCs共孵育2h,流式细胞仪检测示EGFP阳性率前者为28.6%,后者为56.9%,24h后分析DCs的表型,sEGFP-hecdCD40L融合蛋白增强DCs表面CD80、CD83和HLA-DR分子的表达以及刺激IL-12的分泌,而sEGFP对DCs的表型和IL-12的分泌无明显影响。结论用SigmKDR、EGFP和hecdCD40L构建的融合基因能在真核细胞中表达并能分泌至细胞外,这种分泌型融合蛋白能靶向DCs,诱导DCs的成熟和上调其表面共刺激分子和MHC-II分子的表达,并刺激IL-12分泌。
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关键词
蛋白分选信号
绿色荧光蛋白质类
CD40配体
树突细胞
白细胞介素12
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职称材料
多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位
被引量：
2
2
作者
靳志平
谭晓华
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第11期1044-1047,共4页
目的构建一种多基因表达载体,实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位。方法利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽,合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列,形成单一的...
目的构建一种多基因表达载体,实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位。方法利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽,合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列,形成单一的开放读码框,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)Myc/His(B)相应的多克隆位点中,然后将带有膜定位的红色荧光蛋白(ERFP)、核定位的绿色荧光蛋白(EGFP)和胞浆定位的黄色荧光蛋白(EYFP)顺序插入2A肽之间的位点中,构建多基因真核表达载体pcDNA3.1 RGY。用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞,利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位。结果转染24 h后用流式细胞仪检测,可同时检测到EGFP和ERFP的表达,且两种荧光蛋白的表达率十分接近;荧光显微镜下同时观察到绿色和红色荧光;共聚焦显微镜观察到在单一细胞上同时显示3种荧光,ERFP定位在细胞膜上,EGFP在细胞核中,而EYFP在细胞质中。结论通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因。此外,在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器,实现同一细胞中不同的亚细胞定位。
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关键词
真核表达载体
基因表达
信号肽序列
亚细胞定位
2A肽
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职称材料
题名
EGFP-CD40L融合基因的构建、表达及功能鉴定
被引量：
1
1
作者
马晶莹
谭晓华
陈媛媛
邱实
机构
北京军区总医院生物治疗中心
第三军医大学研究生管理大队学员
武警北京总队医院内
出处
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第12期1261-1266,共6页
基金
国家自然科学基金(30771997)~~
文摘
目的构建编码增强型绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,EGFP)和人CD40L胞外段(hecdCD40L)组成的融合基因真核表达载体,并探讨表达后的融合蛋白对人树突状细胞(dendritic cells,DCs)表型和功能的影响。方法以RT-PCR方法从健康人外周血单个核细胞中克隆hecdCD40L基因片段。小鼠血管内皮细胞生长因子受体2信号肽序列(SigmKDR)和EGFP与hecdCD40L基因片段融合或不融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1SigmKDR-EGFP(sEGFP)和pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L。用脂质体将表达载体转染至体外培养的COS-7细胞后,G418抗性筛选,流式细胞仪分选并检测EGFP和/或CD40L的表达。Western blot检测融合蛋白在COS-7细胞及其上清中的表达,用镍柱和超滤离心管获取纯化浓缩的sEGFP-hecdCD40L和sEGFP融合蛋白与人DCs共孵育,流式细胞仪和ELISA分析DCs对2种融合蛋白的摄取率、DCs表型变化以及细胞因子IL-12的分泌。结果 pcDNA3.1sEGFP或pcDNA3.1sEGFP-hecdCD40L转染COS-7细胞后,经G418抗性筛选和流式细胞仪分选筛选获得高效表达融合蛋白的单克隆细胞株,EGFP阳性细胞可达95%以上,Westernblot在细胞内和上清中均能检测到融合蛋白。sEGFP或sEGFP-hecdCD40L与DCs共孵育2h,流式细胞仪检测示EGFP阳性率前者为28.6%,后者为56.9%,24h后分析DCs的表型,sEGFP-hecdCD40L融合蛋白增强DCs表面CD80、CD83和HLA-DR分子的表达以及刺激IL-12的分泌,而sEGFP对DCs的表型和IL-12的分泌无明显影响。结论用SigmKDR、EGFP和hecdCD40L构建的融合基因能在真核细胞中表达并能分泌至细胞外,这种分泌型融合蛋白能靶向DCs,诱导DCs的成熟和上调其表面共刺激分子和MHC-II分子的表达,并刺激IL-12分泌。
关键词
蛋白分选信号
绿色荧光蛋白质类
CD40配体
树突细胞
白细胞介素12
Keywords
protein sorting signals
green fluorescent proteins
CD40 ligand
dendritic cells
interleukin-12
分类号
R394-33 [医药卫生—医学遗传学]
R394.3 [医药卫生—医学遗传学]
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职称材料
题名
多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位
被引量：
2
2
作者
靳志平
谭晓华
机构
北京军区总医院中心实验科
第三军医大学研究生管理大队学员
天津迪艾细胞与分子医学发展有限公司
出处
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012年第11期1044-1047,共4页
基金
国家自然科学基金面上项目(81172162)~~
文摘
目的构建一种多基因表达载体,实现同一载体单一启动子的调控下表达多个基因以及这些基因在同一细胞不同细胞器中的定位。方法利用存在于某些病毒核酸序列中的不同2A肽,合成1段包括2个2A肽和不同限制性内切酶位点的多肽序列,形成单一的开放读码框,插入真核表达载体pcDNA3.1(-)Myc/His(B)相应的多克隆位点中,然后将带有膜定位的红色荧光蛋白(ERFP)、核定位的绿色荧光蛋白(EGFP)和胞浆定位的黄色荧光蛋白(EYFP)顺序插入2A肽之间的位点中,构建多基因真核表达载体pcDNA3.1 RGY。用脂质体转染小鼠成纤维NIH3T3细胞和人肾胚293细胞,利用流式细胞仪、荧光显微镜和共聚焦显微镜检测各种荧光蛋白的表达和亚细胞定位。结果转染24 h后用流式细胞仪检测,可同时检测到EGFP和ERFP的表达,且两种荧光蛋白的表达率十分接近;荧光显微镜下同时观察到绿色和红色荧光;共聚焦显微镜观察到在单一细胞上同时显示3种荧光,ERFP定位在细胞膜上,EGFP在细胞核中,而EYFP在细胞质中。结论通过串联方式将多个2A肽和基因置于同一个开放读码框中可实现在同一启动子的调控下表达多个基因。此外,在每个基因序列中加入不同的信号肽序列可将相应基因同时靶向不同的细胞器,实现同一细胞中不同的亚细胞定位。
关键词
真核表达载体
基因表达
信号肽序列
亚细胞定位
2A肽
Keywords
eukaryotic expression vector
gene expression
signal peptide sequence
sub-cellular location
2A peptide
分类号
Q503 [生物学—生物化学]
Q782 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
EGFP-CD40L融合基因的构建、表达及功能鉴定
马晶莹
谭晓华
陈媛媛
邱实
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2010
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
多基因真核表达载体的构建及其产物的亚细胞定位
靳志平
谭晓华
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2012
2
在线阅读
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职称材料
已选择
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