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带Tat标记质粒载体的构建及其转导融合蛋白进入细胞的研究 被引量:9
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作者 孙学刚 宋革 +5 位作者 刘靖华 李红乐 邢飞跃 张丽华 秦清和 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期354-358,共5页
采用点突变技术构建了带 6×His、Tat和Flag多个标记的pET HTF的质粒载体 ,利用基因重组技术构建pET HTF EGFP融合蛋白载体 .酶切和DNA测序证明 ,所构建的pET HTF和pET HTF EGFP载体正确 .BL2 1(DE3)表达融合蛋白 ,用Ni2 + 分离柱纯... 采用点突变技术构建了带 6×His、Tat和Flag多个标记的pET HTF的质粒载体 ,利用基因重组技术构建pET HTF EGFP融合蛋白载体 .酶切和DNA测序证明 ,所构建的pET HTF和pET HTF EGFP载体正确 .BL2 1(DE3)表达融合蛋白 ,用Ni2 + 分离柱纯化His Tat Flag EGFP蛋白 ,并加入培养的NIH3T3细胞 .荧光显微镜观察显示 ,His Tat Flag EGFP融合蛋白进入细胞 .带His、Tat和Flag标记的质粒载体pET 14b HTF表达的融合蛋白能够进入细胞 。 展开更多
关键词 Tat标记 质粒载体 融合蛋白 细胞 增强型绿色荧光蛋白 蛋白转导
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BDNF重组腺病毒的构建及在大鼠骨髓间质干细胞的表达 被引量:7
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作者 李红乐 李浩威 +5 位作者 邢飞跃 孙学刚 邓宇斌 张秀明 姜勇 李树浓 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期438-442,T001,共6页
目的 :利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体 (proBDNF)和脑源性神经营养因子 (BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC)高效表达。方法 :采用两步亚克隆的方法将proBDN... 目的 :利用大肠杆菌细菌内同源重组构建带有增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因的脑源性神经营养因子前体 (proBDNF)和脑源性神经营养因子 (BDNF)重组腺病毒并在大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC)高效表达。方法 :采用两步亚克隆的方法将proBDNF和BDNF构建入带有EGFP表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移载体pAdTrack -proBDNF和pAdTrack -BDNF ,采用化学转化法在大肠杆菌BJ5 183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy- 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -proBDNF和pAd -BDNF ;转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ;将重组病毒上清感染rMSC ,用荧光显微镜下观察和Western -blotting鉴定重组病毒在rMSC表达 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC在体外诱导向神经样细胞分化 ;用Ad -proBDNF和Ad -BDNF的感染的rMSC接种于裸鼠肌肉内 ,两周后荧光显微镜下直接观察。结果 :成功地构建了proBDNF和BDNF重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外培养的rMSC高效表达并不影响其分化潜能 ,体内移植实验表明Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC能在体内表达。结论 :重组腺病毒具有较高的介导proBDNF和BDNF基因表达于rMSC的效率 ,带有报告基因EGFP的Ad -proBDNF和Ad -BDNF感染的rMSC可以用于体内移植实验。 展开更多
关键词 BDNF 重组腺病毒 构建 大鼠 骨髓间质干细胞 表达 增强型绿色荧光蛋白 基因融合 脑源性神经营养因子
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腺病毒介导的EGFP基因在大鼠骨髓间质干细胞中的高效表达 被引量:11
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作者 李红乐 邢飞跃 +5 位作者 孙学刚 曹永宽 宋革 张秀明 姜勇 李树浓 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期293-296,T002,共5页
目的 :研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法 :在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC) ,用细菌同源重组法构建巨细胞病毒 (CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因腺病毒载体 (p... 目的 :研究复制缺陷型腺病毒感染骨髓间质干细胞介导外源基因表达的可行性及感染效率。方法 :在体外低密度扩增大鼠骨髓间质干细胞 (rMSC) ,用细菌同源重组法构建巨细胞病毒 (CMV)驱动的增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)报告基因腺病毒载体 (pAd -EGFP) ,用 2 93包装细胞制备腺病毒 ,用EGFP重组腺病毒感染rMSC ,观察重组腺病毒携带基因在MSC中的感染和表达情况 ,用细胞计数法和流式细胞仪分析感染效率。用血清撤离加入 β -巯基乙醇诱导Ad -EGFP感染的rMSC向神经样细胞定向分化。结果 :Ad -EGFP可高效感染rMSC ,感染率为 (3 6±2 ) % ,而脂质体法转染质粒pTrack -GFP在rMSC转染效率非常低且不易成功 ;Ad -EGFP感染后的不同扩增代数的rMSC在受到 β -巯基乙醇的诱导分化后在荧光显微镜下呈典型的突触形式。免疫组化鉴定发现这些诱导细胞表达神经元特异烯醇化酶 (NSE) ,表明腺病毒介导外源基因转染后rMSC仍具有分化为神经样细胞的潜能。结论 :腺病毒载体具有较高的介导外源基因表达于rMSC的效率 。 展开更多
关键词 EGFP基因 大鼠 骨髓间质干细胞 腺病毒感染
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应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒 被引量:8
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作者 李红乐 秦清和 +3 位作者 王静珍 邓鹏 李树浓 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第11期1451-1454,共4页
目的 :利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在 2 93细胞制备高滴度重组病毒。方法 :自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR3 1 -CCRK中酶切出CCRK基因 ,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CM... 目的 :利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在 2 93细胞制备高滴度重组病毒。方法 :自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR3 1 -CCRK中酶切出CCRK基因 ,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack -CMV中 ,形成转移质粒pAdTrack -CMV -CCRK ,采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ51 83内与腺病毒骨架质粒pAdEasy - 1同源重组 ,得到重组腺病毒载体pAd -CCRK。以pAd -CCRK为模板 ,经DNA测序正确后 ,用PacI酶切线性化pAd -CCRK ,转染 2 93细胞 ,包装成重组病毒颗粒 ,荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达 ,采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞 ,荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果 :成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒 ,重组病毒能在体外高效表达。结论 :应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体 ,可高效制备均一的高滴度重组病毒 。 展开更多
关键词 腺病毒 同源重组 荧光蛋白 细菌
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晚期糖基化终产物受体的结构和功能 被引量:21
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作者 赵善超 侯凡凡 姜勇 《生理科学进展》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期71-73,共3页
晚期糖基化终产物受体 (RAGE)是一种膜蛋白 ,属于免疫球蛋白家族 ,由 4 0 0多个氨基酸组成 ,分子量为 35kD ,分胞外段、跨膜段和胞内段 ,在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等细胞中普遍表达。RAGE作为信... 晚期糖基化终产物受体 (RAGE)是一种膜蛋白 ,属于免疫球蛋白家族 ,由 4 0 0多个氨基酸组成 ,分子量为 35kD ,分胞外段、跨膜段和胞内段 ,在单核巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等细胞中普遍表达。RAGE作为信号转导受体介导晚期糖基化终产物 (AGE)和其配体在细胞表面结合 ,激活细胞内多种信号转导机制 ,在糖尿病慢性并发症、透析相关性淀粉样变 (DRA)、阿尔采末病 (AD)、动脉粥样硬化等疾病发生中起重要作用。对RAGE结构和功能的认识可能为这些疾病的防治提供新的靶位 。 展开更多
关键词 晚期糖基化终产物受体 结构-功能研究 信号转导
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人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备 被引量:4
6
作者 莫永炎 刘亚伟 +4 位作者 王静珍 邓鹏 秦清和 杨志刚 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期168-172,共5页
为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1c... 为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 。 展开更多
关键词 信号传导分子 蛋白激酶C相关激酶1相关蛋白 原核表达 制备 GST-AWP1融合蛋白 多克隆抗体
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用T7噬菌体展示筛选系统筛选与p38相结合的蛋白 被引量:7
7
作者 李志杰 刘靖华 +9 位作者 龚小卫 秦清和 黄浩 邓鹏 王静珍 孙学刚 赵善超 刘亚伟 赵克森 姜勇 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第11期1131-1133,共3页
目的用T7噬菌体筛选系统筛选与重要信号分子p38 MAPK结合的蛋白。方法以p38 MAPK为靶蛋白,分别用不同的介质(ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂)筛选T7人肝和人肺cDNA文库。结果选择86个第4轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用... 目的用T7噬菌体筛选系统筛选与重要信号分子p38 MAPK结合的蛋白。方法以p38 MAPK为靶蛋白,分别用不同的介质(ELISA平板和Ni-NTA亲和树脂)筛选T7人肝和人肺cDNA文库。结果选择86个第4轮筛选后的洗脱噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片断,回收PCR产物并进行测序,将所得到的序列用BLAST软件搜索GenBank中的同源序列,得到了46个编码蛋白的序列。结论T7噬菌体展示筛选系统筛选新的结合蛋白简单、快速、有效。 展开更多
关键词 T7噬菌体 筛选 P38 结合蛋白 靶蛋白
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报告基因技术的理论基础及其应用 被引量:18
8
作者 刘志锋 姜勇 《生理科学进展》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期361-363,共3页
报告基因技术广泛地应用于监测细胞的信号转导和基因表达,通过把转录控制元件剪接到报告基因,可以直观地“报道”细胞内与基因表达有关的信号级联。这种检测具有敏感性高、方便、可靠而且适用于大规模检测等优点。随着报告基因技术及其... 报告基因技术广泛地应用于监测细胞的信号转导和基因表达,通过把转录控制元件剪接到报告基因,可以直观地“报道”细胞内与基因表达有关的信号级联。这种检测具有敏感性高、方便、可靠而且适用于大规模检测等优点。随着报告基因技术及其检测方法的不断改进,荧光素酶、绿色荧光蛋白以及新近克隆出的红色荧光蛋白作为无害性的检测工具,将在检测活体组织和细胞基因表达方面得到越来越广泛的应用。此外,在研究疾病发生的分子机制,基因治疗和药物开发方面,报告基因技术也将发挥出重要作用。本文对报告基因技术的基础理论、常用报告基因的种类和特点,以及其目前的主要应用作了概括性介绍。 展开更多
关键词 报告基因技术 理论基础 应用 荧光蛋白 信号检测 基因表达
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p38MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达 被引量:8
9
作者 龚小卫 秦清和 +1 位作者 王静珍 姜勇 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第2期171-173,共3页
目的构建在哺乳动物细胞中表达的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体。方法将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上,随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察结果。结果重组质... 目的构建在哺乳动物细胞中表达的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体。方法将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上,随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经酶切、PCR和测序证明正确无误,并在HeLa细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的红色荧光表明p38MAPK弥散分布于细胞质中,细胞核中也有一定的分布。结论成功构建了p38MAPK红色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具。 展开更多
关键词 丝裂原活化蛋白激酶 红色荧光蛋白 载体构建 基因表达
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FRET的理论基础及应用 被引量:10
10
作者 孙学刚 张丽华 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第9期1721-1724,1738,共5页
The structural and functional study of protein is a major topic of current functional genomics. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is one of few tools available for measuring nanometer scale distances and c... The structural and functional study of protein is a major topic of current functional genomics. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is one of few tools available for measuring nanometer scale distances and changes in distances in vivo . FRET is an ideal technology for detection of protein conformation and protein-protein interaction by using fluorescence protein, traditional organic dyes and other dyes as probes. It uses fluorescence protein, traditional organic dyes and other dyes as its probes. The application of FRET in the determination of intracellular events would be helpful for us to understand the structure and function of biology molecules. [ 展开更多
关键词 荧光共振能量转移 蛋白质相互作用
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p38蛋白激酶不同亚型在RAW264.7细胞中的定位 被引量:7
11
作者 张琳 姜勇 张璐 《第一军医大学学报》 CSCD 2000年第3期193-196,共4页
目的 探讨p38的4种亚型在细胞中的分布以及对外界刺激的反应。方法 应用激光共聚焦显微镜对RAW264.7单核细胞内的4种亚型进行定位观察。结果 p38(、p38(在未受刺激的静息细胞内的荧光强度呈弥散性分布,受脂多糖(LPS)刺激后,细胞核... 目的 探讨p38的4种亚型在细胞中的分布以及对外界刺激的反应。方法 应用激光共聚焦显微镜对RAW264.7单核细胞内的4种亚型进行定位观察。结果 p38(、p38(在未受刺激的静息细胞内的荧光强度呈弥散性分布,受脂多糖(LPS)刺激后,细胞核荧光强度明显增强,细胞浆荧光强度降低,提示LPS诱导p38(和p38(磷酸化活化后移位入细胞核。p38(在静息和受LPS刺激后的细胞中均呈散在、弥漫性地分布,提示p38(刺激后无移位现象。静息时,p38(弥散地分布于细胞,刺激后细胞核膜部荧光强度增高,提示受刺激后p38(移位于核膜周围。结论 p38不同亚型在细胞受LPS刺激后移位表现不同,可能与它们在组织和细胞分布的特异性及作用途径有关。 展开更多
关键词 P38蛋白激酶 定位 RAW264.7细胞
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TLR4全长及其截断体重组腺病毒的制备和功能鉴定 被引量:1
12
作者 宋革 孙学刚 +3 位作者 秦清和 邓鹏 刘靖华 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期352-357,共6页
制备脂多糖 (LPS)Toll样受体 4 (TLR4 )全长及其胞内段缺失的TLR4截断体 (ΔTLR4 )的绿色荧光蛋白重组腺病毒并鉴定其功能 .用PCR方法扩增TLR4及ΔTLR4基因片段 ,酶切后亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成带有目的基因的穿梭载体pAdTrack T... 制备脂多糖 (LPS)Toll样受体 4 (TLR4 )全长及其胞内段缺失的TLR4截断体 (ΔTLR4 )的绿色荧光蛋白重组腺病毒并鉴定其功能 .用PCR方法扩增TLR4及ΔTLR4基因片段 ,酶切后亚克隆至腺病毒穿梭质粒中 ,形成带有目的基因的穿梭载体pAdTrack TLR4和pAdTrack ΔTLR4 .用BJ5 1 83细菌同源重组法将目的基因重组于腺病毒骨架载体中 ;将重组腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后 ,用脂质体法转染HEK 2 93细胞进行腺病毒的包装扩增 .将重组腺病毒感染CHO K1细胞 ,采用荧光毒酶报告基因方法检测其对LPS诱导NF κB激活的影响 .酶切及测序表明 ,TLR4全长及其截断体ΔTLR4的重组腺病毒载体构建正确 .荧光素酶报告基因检测结果表明 ,TLR4全长及其截断体的重组腺病毒感染细胞对LPS诱导的反应具有不同的影响 ,Ad ΔTLR4明显抑制了LPS引起的NF κB激活 (P <0 0 5 ) ,Ad TLR4则使LPS引起的NF κB活性增强 (P <0 0 5 ) . 展开更多
关键词 腺病毒 TLR4基因 报告基因 NF-KB
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iNOS红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达 被引量:1
13
作者 刘志锋 阚文宏 +3 位作者 秦清和 邓鹏 王静珍 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期1709-1712,共4页
目的 :构建iNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体 ,为研究细胞内iNOS的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具。方法 :采用基因重组技术构建了含iNOS启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1- 1-iNOSp ;用脂质体瞬时转... 目的 :构建iNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体 ,为研究细胞内iNOS的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具。方法 :采用基因重组技术构建了含iNOS启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1- 1-iNOSp ;用脂质体瞬时转染NIH3T3细胞 ,观察iNOS启动子对脂多糖 (LPS)刺激的反应。结果 :酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的 ;该表达载体在NIH3T3细胞静息状态下表达水平很低 ,经LPS刺激后 ,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论 :所构建的iNOS启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的 ,对生理相关刺激有很好的反应 ,可有效地用于iNOS基因表达信号调控机制的研究。 展开更多
关键词 一氧化氮合酶 红色荧光蛋白 基因 调节 基因 报告
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LPS刺激对RAW264.7细胞p38蛋白激酶的细胞内定位的影响 被引量:1
14
作者 张琳 姜勇 张璐 《第一军医大学学报》 CSCD 2000年第3期197-201,共5页
目的 探讨p38蛋白激酶信号传导的过程及其在细胞中的特异性作用机制。方法 应用间接荧光标记免疫探针技术及共聚焦激光扫描技术观察单核细胞中p38蛋白激酶的分布及LPS对其分布的影响。结果p38在未受刺激的静息单核细胞及内皮生长因子(... 目的 探讨p38蛋白激酶信号传导的过程及其在细胞中的特异性作用机制。方法 应用间接荧光标记免疫探针技术及共聚焦激光扫描技术观察单核细胞中p38蛋白激酶的分布及LPS对其分布的影响。结果p38在未受刺激的静息单核细胞及内皮生长因子(EGF)刺激的单核细胞胞浆和胞核中荧光强度均呈弥散性分布;脂多糖(LPS)刺激使细胞核区的荧光强度明显增强,而胞浆区域的荧光强度降低。激酶动力学的研究显示,p38激活先于p38移位。LPS刺激后30 min,p38激酶活性即达到高峰,随后2 h内逐步下降,p38激酶活性呈一过性增高;LPS刺激45 min后,核区荧光强度达到峰值,且在2 h内维持在高水平。结论 单核细胞由LPS激活后,其p38蛋白激酶由胞浆转位到胞核,反应具有一定的特异性;p38移位入核依赖于p38磷酸化活化及由细胞浆移位到细胞核是一系列连续发生的事件。 展开更多
关键词 P38蛋白激酶 LPS刺激 RAW264.7细胞 细胞内定位
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钙依赖性粘附素及其信号转导 被引量:1
15
作者 闫文生 姜勇 《生理科学进展》 CAS CSCD 北大核心 2000年第4期353-356,共4页
钙依赖性粘附素介导的粘附连接在决定和维持发育及成年机体的组织结构中起着重要作用。钙依赖性粘附素结合的特异性取决于其细胞外段 ,但完整的生理性粘附还需其胞质尾段与胞质相关蛋白以及细胞骨架的相互作用和联系。粘附连接的调节涉... 钙依赖性粘附素介导的粘附连接在决定和维持发育及成年机体的组织结构中起着重要作用。钙依赖性粘附素结合的特异性取决于其细胞外段 ,但完整的生理性粘附还需其胞质尾段与胞质相关蛋白以及细胞骨架的相互作用和联系。粘附连接的调节涉及到钙依赖性粘附素基因表达、聚集和磷酸化以及缝隙连接通讯等 ;此外 ,钙依赖性粘附素 连环素复合体还参与信号转导过程 。 展开更多
关键词 钙依赖性粘附素 粘附连接 信号转导
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用T7噬菌体展示筛选系统筛选与靶蛋白相结合的蛋白
16
作者 刘靖华 李志杰 +6 位作者 刘亚伟 黄浩 邓鹏 秦清和 赵善超 赵克森 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第12期1666-1666,共1页
关键词 T7噬菌体 示筛选系统 筛选 靶蛋白
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人ARPC2基因的克隆与表达
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作者 龚小卫 彭毅 +4 位作者 刘靖华 李志杰 邓鹏 秦清和 姜勇 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第6期628-630,635,共4页
目的构建人His-ARPC2融合蛋白表达载体,并在原核细胞中进行表达与纯化,以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法从人肝cDNA文库扩增ARPC2基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pET-14b载体中。对阳性克隆进行酶切... 目的构建人His-ARPC2融合蛋白表达载体,并在原核细胞中进行表达与纯化,以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法从人肝cDNA文库扩增ARPC2基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pET-14b载体中。对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。转化BL21(DE3)大肠杆菌株,用异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该融合蛋白。结果所构建的人ARPC2的His融合蛋白表达载体是正确的,该载体可在大肠杆菌内高效表达,用Ni-NTA纯化获得了相对分子质量约36 000的融合蛋白。结论成功构建了人His-ARPC2融合蛋白表达载体,并在原核细胞中获得了高效表达和纯化,为进一步研究ARPC2的生理功能提供了重要的实验材料。 展开更多
关键词 载体构建 基因表达 蛋白纯化 ARPC2
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