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人PSP94与TNFα衍生物联合治疗人前列腺癌的实验研究 被引量：1
1
作者 刘丽 刘庆鑫 +4 位作者 刘立忠 石缨 谢宝树 冷爱军 曹颖 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 2000年第4期546-550,共5页
构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别... 构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行了 PSP94与 TNFαD1 1 a联合治疗人前列腺癌的实验研究 .当动物肿瘤直径长至约 1 0 mm时 ,将以上 3种真核表达质粒分别以 50 μg/只的量给相应组动物的左右四头肌内注射一次 ,同时设 pc DNA3.0空载体对照组 ;rh PSP9450μg/kg、rh TNFαD1 1 a 1 0 0万单位 /kg、rh PSP94和 rh TNFαD1 1 a以同样剂量联合给药 ,肌肉注射 ,每 d一次 ,连续 1 0 d,同时设环磷酰胺阳性对照组和生理盐水阴性对照组 .基因治疗动物给药后第 1 5d处死 ,蛋白治疗组停药后第 2 d处死 ,观察疗效 ,计算抑瘤率 .结果显示 ,以上述方式给药 ,无论是基因治疗组还是重组蛋白组 ,给 PSP94的动物肿瘤虽然未见明显缩小 ,但肿瘤组织均出现不同程度的坏死和液化现象 ;给 TNFαD1 1 a的未见明显的抑瘤效果 ;PSP94-TNFαD1 1 a融合基因或 rh PSP94+ rh TNFαD1 1 a联合给药 ,不仅肿瘤有所缩小 ,而且也有不同程度的坏死和液化现象出现 .初步认为 :( 1 ) 展开更多
关键词 PSP94 TNFα衍生物 基因治疗 前列腺癌
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人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析 被引量：7
2
作者 田生礼 刘丽 +5 位作者 芦兴武 孟岩 谢宝树 刘立忠 王颖 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第4期358-364,共7页
外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上，获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα，对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计，使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分... 外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上，获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα，对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计，使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析，分子量约为６６ｋＤ处蛋白条带可被ＴＰＯ抗体识别；表达量约为０．１ｇ／Ｌ；Ｎ端氨基酸序列分析结果与设计的一致；表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（ｍｅｇａｋａｒｙ－ｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ－Ｍｅｇ）具有明显的刺激作用． 展开更多
关键词 血小板生成素 毕赤酵母 分泌表达 活性测定
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SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白 被引量：5
3
作者 刘丽 徐琪 +4 位作者 胡晓冥 刘立忠 王颖 谢宝树 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第4期517-521,共5页
通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况，从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ ... 通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白中对 Ｉ Ｌ６ 和 Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构的影响情况，从中选择了 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ接头．以 Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ 作为接头的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和以 Ｐ Ｇ 为接头的５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ空间结构预测结果相似． Ｄ Ｎ Ａ 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致．５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ和 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后，生物学活性及对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示：在 Ｌ９２９细胞上，前者的生物学活性是后者的 ２７ 倍；在 Ｕ９３７ 细胞上，前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的１３ 倍．它们对高表达 Ｉ Ｌ６ 受体的 Ｕ９３７ 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 Ｔ Ｎ Ｆα衍生物的３７ 和 ２９ 倍．实验表明， Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｓ Ａ Ｐ Ｇ Ｔ Ｐ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白优于以 Ｐ Ｇ 作为接头构建的 ５′ Ｉ Ｌ６ Ｐ Ｇ Ｔ Ｎ ＦΔ融合蛋白． 展开更多
关键词 融合蛋白 接头 白细胞介素6 衍生物 TNF
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酵母系统表达TPO与E.coli表达TPO N端结构域生物半衰期比较
4
作者 刘丽 田生礼 +5 位作者 王颖 芦兴武 孟岩 谢宝树 刘立忠 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第6期784-789,共6页
为了探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其生物半衰期的关系，首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人ＴＰＯ成熟肽和大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ端结构域蛋白．纯化产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定和活性分析后，两种蛋白以相同浓度... 为了探讨血小板生成素（ＴＰＯ）糖基化与其生物半衰期的关系，首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人ＴＰＯ成熟肽和大肠杆菌表达的人ＴＰＯＮ端结构域蛋白．纯化产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定和活性分析后，两种蛋白以相同浓度或相同活性单位给Ｗｉｓｔｅｒ大鼠尾静脉注射，利用酶联免疫分析（ＥＬＩＳＡ）和ＴＦ１细胞测定不同时间点实验动物血浆中ＴＰＯ浓度或生物学活性，求出两种ＴＰＯ的生物半衰期（ｔ１／２）值．结果显示，以相同浓度和相同活性单位给药，ＴＰＯ成熟肽的ｔ１／２均比其Ｎ端结构域的长，前者分别是后者的１．６５倍和１．２７倍． 展开更多
关键词 血小板生成素 糖基化 生物半衰期 N端结构
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人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建 被引量：7
5
作者 刘庆鑫 刘丽 +4 位作者 刘建香 刘立忠 王颖 谢宝树 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第3期359-364,共6页
利用ＲＴ－ＰＣＲ从人肥大前列腺组织钓取９４个氨基酸的人前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）全长ｃＤＮＡ，序列分析结果与文献报道的完全一致．将ＰＳＰ９４成熟肽与人ＴＮＦα衍生物（ＴＮＦΔ）通过Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＡＰＧＴＰ在基因水... 利用ＲＴ－ＰＣＲ从人肥大前列腺组织钓取９４个氨基酸的人前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）全长ｃＤＮＡ，序列分析结果与文献报道的完全一致．将ＰＳＰ９４成熟肽与人ＴＮＦα衍生物（ＴＮＦΔ）通过Ｌｉｎｋｅｒ－ＳＡＰＧＴＰ在基因水平上融合成５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ，融合基因ＤＮＡ序列分析结果与设计的相符合．５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为３１ｋＤ，表达量约占菌体总蛋白量的３５％．以Ｌ９２９细胞和人前列腺癌细胞株ＰＣ－３为靶细胞进行细胞毒分析结果表明，５′ＰＳＰ９４－ＴＮＦΔ融合蛋白既具有ＴＮＦ的细胞毒活性。 展开更多
关键词 TNF衍生物 融合蛋白 PSP94 前列腺癌 细胞毒
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人PSP94的分泌表达及其表达产物抗前列腺癌作用 被引量：2
6
作者 刘丽 刘建香 +4 位作者 刘立忠 石缨 谢宝树 冷爱军 曹颖 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第4期542-545,共4页
将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9m... 将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 . 展开更多
关键词 前列腺分泌蛋白 TNF衍生物 前列腺癌 抗肿瘤
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人TPON端结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析 被引量：1
7
作者 刘丽 田生礼 +3 位作者 王艳华 孟岩 芦兴武 谢宝树 《生物化学杂志》 CSCD 1997年第6期666-671,共6页
在利用反转录－ＰＣＲ从人胎肝中获得编码人血小板生成素（ｈＴＰＯ）全长ｃＤ－ＮＡ的基础上，综合ＴＰＯ结构与功能的研究信息，在大肠杆菌中表达了成熟肽Ｎ端结构域．目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的３０... 在利用反转录－ＰＣＲ从人胎肝中获得编码人血小板生成素（ｈＴＰＯ）全长ｃＤ－ＮＡ的基础上，综合ＴＰＯ结构与功能的研究信息，在大肠杆菌中表达了成熟肽Ｎ端结构域．目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白的３０％；包涵体经变性、复性、凝胶过滤、离子交换层析等步骤处理后，所得产物给Ｂａｂｌ／ｃ小鼠腹腔连续注射８ｄ，第９ｄ摘眼球采血，计数血小板的数量．结果表明，ＴＰＯＮ端结构域具有明显促进血小板生成的作用． 展开更多
关键词 血小板生成素 遗传工程 药物 N端结构域 研制
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微量免疫荧光试验和PCR在诊断肺炎衣原体急性感染中的应用
8
作者 李建标 蔡庆 +4 位作者 王颖 赵建中 端青 纪树国 朱美财 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期459-461,共3页
目的　探讨肺炎衣原体 (Cpn)急性感染在呼吸道疾病中的重要性。方法　用微量免疫荧光 (MIF)试验检测了 93例住院病人血清中Cpn抗体IgG ,同时用PCR测定了其中 5 5例病人咽试子标本中CpnDNA。结果　 3 5 .5 %呼吸道疾病存在Cpn急性感染。... 目的　探讨肺炎衣原体 (Cpn)急性感染在呼吸道疾病中的重要性。方法　用微量免疫荧光 (MIF)试验检测了 93例住院病人血清中Cpn抗体IgG ,同时用PCR测定了其中 5 5例病人咽试子标本中CpnDNA。结果　 3 5 .5 %呼吸道疾病存在Cpn急性感染。在肺炎组抗体 (效价≥ 5 12 )阳性率为 47.6% ,提示 1998～ 1999年可能处在北京市Cpn流行期 ;在哮喘组的阳性率达到 5 0 % ;在肺心病组和肺癌组的阳性率分别为 5 0 .0 %和 2 6.3 %。PCR检测Cpn的阳性率仅为 9.1% ,MIF和PCR的检测结果存在差别。结论　检测Cpn抗体IgG有助于对Cpn急性感染进行诊断 。 展开更多
关键词 衣原体感染 呼吸道疾病 荧光免疫测定 聚合酶链反应 PCR 肺炎
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外源血小板生成素基因体内导入对循环免疫因子水平的影响 被引量：3
9
作者 赵建增 刘丽 梅英杰 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第3期103-105,共3页
目的：研究外源ＴＰＯ基因由质粒载体导入后，小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法：用脂质体将表达人ＴＰＯ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｈＴＰＯ包裹后，注射到Ｂａｌｂ／ｃ鼠的后肢肌肉内，用ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血液中多种细胞... 目的：研究外源ＴＰＯ基因由质粒载体导入后，小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法：用脂质体将表达人ＴＰＯ的真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３／ｈＴＰＯ包裹后，注射到Ｂａｌｂ／ｃ鼠的后肢肌肉内，用ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血液中多种细胞因子的水平。结果：在ＴＰＯｃＤＮＡ转移到体内后，血液中ＩＦＮγ、ＴＮＦα和ＩＬ２迅速升高。其中，ＩＦＮγ与血小板计数呈明显负相关，并且在血小板计数回落后，保持在对照水平的９～１２倍；ＴＮＦα仅在第１周内与之成正相关，但可达对照水平的１２０倍；ＩＬ２升高幅度较小，与ＴＰＯ水平相一致。血液中Ⅱ型组织相容性抗原分子也呈升高趋势，与ＩＬ２的变化类似；而Ⅰ型分子与ＴＮＦα的变化相似。结论：ＴＰＯ在多方面刺激了机体免疫机能，而免疫因子如ＩＦＮγ在血小板生成过程中起重要的调节作用。 展开更多
关键词 血小板生成素 免疫调节 IFN-Γ TNF-α IL-2
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KDP胞外502～764位氨基酸基因合成、表达及功能鉴定 被引量：2
10
作者 刘立忠 肖畅 +5 位作者 刘丽 谢宝树 徐福 冷爱军 曹颖 朱迅 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第1期86-91,共6页
应用基因搭桥法及 Taq酶聚合反应合成了编码人血管内皮生长因子受体 - ( h VEGFR- ,KDR)第 50 2～ 764位 2 62个氨基酸的基因片段 .DNA序列分析表明 ,合成的 786bp的基因片段与文献报道的 KDR相应 c DNA序列完全一致 .将该基因与原核... 应用基因搭桥法及 Taq酶聚合反应合成了编码人血管内皮生长因子受体 - ( h VEGFR- ,KDR)第 50 2～ 764位 2 62个氨基酸的基因片段 .DNA序列分析表明 ,合成的 786bp的基因片段与文献报道的 KDR相应 c DNA序列完全一致 .将该基因与原核融合蛋白表达载体 p GEX- 3X重组 ,在大肠杆菌 JM1 0 9中表达了 GST- KDR2 62融合蛋白 ,表达量约占菌体总蛋白的 35% .表达产物依次经包涵体分离、变性、复性、亲合层析纯化和 Xa因子酶解 ,获得了 KDR2 62目的蛋白纯品 .GST-KDR2 62融合蛋白和纯化产物经 Western blot分析 ,两者均可被 VEGF1 65特异性识别 ,前者分子量约 56k D,后者分子量约 30 k D;这两种蛋白用 VEGF1 65及其抗体进行的 ELISA分析结果均显示阳性 ,并有剂量依赖关系 ,而用 Xa因子酶解 GST- KDR2 62融合蛋白获得的 GST和空载体诱导产物对照均为阴性 .以上结果表明表达的 KDR2 62蛋白可特异性地与 VEGF结合 . 展开更多
关键词 基因合成 蛋白表达 KDR 肿瘤治疗 人源化Fab抗体
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