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人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
被引量：
6
1
作者
余惠珍
谢良地
+3 位作者
朱鹏立
许昌声
王华军
李体远
《中国病理生理杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2008年第2期411-416,共6页
目的:构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒(Ad-hKLK1-IRES-EGFP),并观察在自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1,将hKLK1基因定向...
目的:构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒(Ad-hKLK1-IRES-EGFP),并观察在自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1,将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建成重组穿梭质粒,将其与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染293A细胞,经包装并获得重组腺病毒,用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定,测定病毒滴度;用重组腺病毒感染VSMCs,用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率,用RT-PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确,并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP,其滴度为4.5×1011/L。重组腺病毒感染VSMCs后,在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达,感染率高达90%以上,可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达,并与感染时间(1 d-7 d)有显著依赖关系,峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP;感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达,该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。
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关键词
基因
人组织激肽释放酶
重组腺病毒载体
血管平滑肌细胞
绿色荧光蛋白
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职称材料
大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定
被引量：
4
2
作者
黄捷
谢良地
+1 位作者
许昌声
王华军
《中国药理学通报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第4期488-492,共5页
目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达s...
目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。
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关键词
热休克蛋白27
RNA干扰
基因疗法
慢病毒
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职称材料
题名
人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
被引量：
6
1
作者
余惠珍
谢良地
朱鹏立
许昌声
王华军
李体远
机构
福建省高血压病研究所
福建
医科大学省立临床医学院二内科
深圳市人民医院
出处
《中国病理生理杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2008年第2期411-416,共6页
基金
福建省教授发展基金资助项目(No.JS06042)
福建省医学创新课题资助项目(No.2007-CX-14)
文摘
目的:构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒(Ad-hKLK1-IRES-EGFP),并观察在自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1,将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中,构建成重组穿梭质粒,将其与腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染293A细胞,经包装并获得重组腺病毒,用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定,测定病毒滴度;用重组腺病毒感染VSMCs,用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率,用RT-PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确,并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP,其滴度为4.5×1011/L。重组腺病毒感染VSMCs后,在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达,感染率高达90%以上,可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达,并与感染时间(1 d-7 d)有显著依赖关系,峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP;感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达,该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。
关键词
基因
人组织激肽释放酶
重组腺病毒载体
血管平滑肌细胞
绿色荧光蛋白
Keywords
Genes, human tissue kallikrein
Recombinant adenovirus vector
Vascular smooth muscle cells
Green fluorescent protein
分类号
R363 [医药卫生—病理学]
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职称材料
题名
大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定
被引量：
4
2
作者
黄捷
谢良地
许昌声
王华军
机构
福建
医科大学附属第一医院
福建省高血压病研究所
出处
《中国药理学通报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第4期488-492,共5页
基金
福建省卫生厅医学创新课题资助项目(No2008J0082)
福建省教育厅教授学术发展基金资助项目(NoJS06042)
文摘
目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。
关键词
热休克蛋白27
RNA干扰
基因疗法
慢病毒
Keywords
HSP27
RNA interference
gene therapy
lentivirus
分类号
R-332 [医药卫生]
R341 [医药卫生—基础医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
余惠珍
谢良地
朱鹏立
许昌声
王华军
李体远
《中国病理生理杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2008
6
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定
黄捷
谢良地
许昌声
王华军
《中国药理学通报》
CAS
CSCD
北大核心
2009
4
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职称材料
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