慢病毒介导新型Tet-On系统调控大鼠GDNF和TH双基因表达对帕金森病大鼠的实验研究 被引量：5

1

作者 张阳 张志坚 +5 位作者 俞晓岚 陈东平 吴秀丽 王志红 陈祖盛 陈秋红 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期251-256,共6页

目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-G... 目的观察改良Tet-On系统修饰慢病毒(Lv-TH-GDNF)目的基因的表达调控及纹状体内直接转移对帕金森病(PD)大鼠的作用。方法 1用Lv-TH-GDNF与rt TA2s-M2病毒感染He La细胞,免疫印迹法检测强力霉素(Dox)对TH、GDNF基因表达的调控。2用Lv-TH-GDNF与rt TA2sM2病毒共同注射到PD大鼠患侧纹状体,Dox诱导目的基因表达。通过观察阿扑吗啡(APO)诱导旋转行为、黑质多巴胺能神经元数量、患侧纹状体DA、DOPAC含量评估Lv-THGDNF治疗效应;通过移植侧纹状体内TH与GDNF蛋白量评估外源基因在体内的表达。结果 1在体外He La细胞实验,仅Dox阳性组见TH、GDNF蛋白条带。2在动物体内实验,病毒移植4周后,与PBS对照组相比,仅病毒+Dox组大鼠旋转行为明显改善(P<0.01),损伤侧黑质致密部TH阳性细胞数、纹状体DA、DOPAC含量及TH和GDNF蛋白量明显增高(P<0.01)。结论新型Tet-On系统修饰的Lv-THGDNF目的基因表达受四环素类抗生素调控,在体外实验未见基础活动,且纹状体内直接转移对PD大鼠有一定治疗作用。 展开更多

关键词 Tet-On系统 TH基因 GDNF基因 帕金森病 慢病毒 大鼠

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Ang-1基因修饰的骨髓间质干细胞移植治疗脑梗死的实验研究 被引量：11

2

作者 陈柏龄 陈东平 +3 位作者 张志坚 黄东煜 吴秀丽 张彦定 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期241-247,共7页

目的:观察血管生成素-1(Ang-1)和骨髓间质干细胞(MSCs)对脑梗死的联合治疗作用。方法:构建带有大鼠Ang-1基因的慢病毒载体,感染大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)获得可表达具有生物活性Ang-1蛋白的rMSCs(Ang-rMSCs)。制备大鼠大脑中动脉栓塞模... 目的:观察血管生成素-1(Ang-1)和骨髓间质干细胞(MSCs)对脑梗死的联合治疗作用。方法:构建带有大鼠Ang-1基因的慢病毒载体,感染大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)获得可表达具有生物活性Ang-1蛋白的rMSCs(Ang-rMSCs)。制备大鼠大脑中动脉栓塞模型,随机分为对照组、Ang-rMSCs组及空载体-rMSCs(pNL-rMSCs)组。脑栓塞术后24h进行细胞移植。各组大鼠分别于术后24h、移植后1周、1月及3月用mNSS量表评价神经功能状况,移植后1周应用伊文思蓝(EB)检测血脑屏障通透性,应用荧光激发及荧光免疫组化观察移植细胞在脑内的存活、分化情况,并经组织学观察有无成瘤迹象。结果:与对照组相比,移植后1周、1月,pNL-rMSCs及Ang-rMSCs组神经功能改善明显(P<0.01),Ang-rMSCs组明显优于pNL-rMSCs组(P<0.001)。移植后3月3组间的mNSS评分差异无显著(P>0.05)。EB检测示血脑屏障通透性在pNL-rMSCs及Ang-rMSCs组低于对照组(P<0.01),Ang-rMSCs组低于pNL-rMSCs组(P<0.01)。移植后1周、1月及3月,Ang-rMSCs和pNL-rMSCs组在荧光激发下均见移植细胞在梗死灶及其周边区聚集并存活。荧光免疫组化检测示Ang-rMSCs组中移植细胞大量表达Ang-1,两移植组中均有部分细胞可同时表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)或星形胶质细胞标志物神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。未观察到移植细胞异常增殖等成瘤迹象。结论:Ang-1基因修饰的rMSCs移植后可迁移至脑梗死灶周围,分化表达神经细胞标志物并较长期存活。MSCs移植与其分泌的Ang-1蛋白可协同促进脑梗死后神经功能恢复。 展开更多

关键词 骨髓间质干细胞 慢病毒载体 血管生成素-1 脑梗死

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联合应用多重聚合酶链反应和变性高效液相色谱法筛查缺失型Duchenne型肌营养不良 被引量：6

3

作者 陈枝挺 陈万金 +3 位作者 吴志英 王柠 林珉婷 慕容慎行 《中国现代神经疾病杂志》 CAS 2008年第2期119-123,共5页

目的建立准确、快速的缺失型Duchenne型肌营养不良筛查方法。方法以35个家系中的35例临床诊断明确的Duchenne型肌营养不良男性患者为研究对象,对dystrophin基因(DMD基因)缺失突变热区的11对引物分2组进行多重聚合酶链反应,扩增产物分别... 目的建立准确、快速的缺失型Duchenne型肌营养不良筛查方法。方法以35个家系中的35例临床诊断明确的Duchenne型肌营养不良男性患者为研究对象,对dystrophin基因(DMD基因)缺失突变热区的11对引物分2组进行多重聚合酶链反应,扩增产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳和变性高效液相色谱法检测,根据检测结果对患者的基因缺失情况进行判断。结果2%琼脂糖凝胶电泳检测显示,正常对照组共出现11条电泳条带,分别代表11个外显子;DMD基因缺失型突变患者表现为部分电泳条带缺失。变性高效液相色谱法检测显示,正常对照组共出现11个洗脱峰,分别代表11个外显子;DMD基因缺失型突变患者表现为部分洗脱峰消失。35例Duchenne型肌营养不良患者中19例呈缺失型突变,两种检测方法所得结果一致。结论联合应用多重聚合酶链反应琼脂糖凝胶电泳和变性高效液相色谱法筛查缺失型Duchenne型肌营养不良患者准确、快速,可应用于缺失型Duchenne型肌营养不良患者的基因诊断。 展开更多

关键词 聚合酶链反应 色谱法 高压液相 肌营养不良 基因 遗传学技术

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慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内转移对帕金森病大鼠模型的保护作用 被引量：3

4

作者 张阳 张志坚 +2 位作者 俞晓岚 黄志新 吴秀丽 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期234-239,共6页

目的探讨慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因直接转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法将携带TH、GDNF基因并含启动子为Palb的四环素应答元件的慢病毒(Lv-TH-GDNF)和四环素... 目的探讨慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因直接转移对帕金森病(PD)大鼠的保护作用。方法将携带TH、GDNF基因并含启动子为Palb的四环素应答元件的慢病毒(Lv-TH-GDNF)和四环素反式作用子rtTA2s-M2病毒共同注射到SD大鼠左侧纹状体,用强力霉素(DOX)诱导大鼠目的基因GDNF和TH的表达。1周后在大鼠的同侧纹状体注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)损毁纹状体的DA能神经元。通过旋转行为、黑质TH免疫组化染色以及高效液相色谱-电化学方法(HPLC-ECD)检测纹状体DA含量评估其保护效应;通过RT-PCR、免疫印迹观察Lv-TH-GDNF在脑内的表达。实验与健康对照组、磷酸缓冲液(PBS)对照组进行比较。结果在6-OHDA损伤后4周,Lv-TH-GDNF+rt-TA2s-M2+DOX组大鼠阿扑吗啡诱发的旋转效应均明显低于PBS对照组(P<0.01),损毁侧的的黑质区TH阳性细胞表达强度、纹状体DA含量均明显高于PBS对照组(P<0.01),但二者均低于健康对照组(P<0.01)。RT-PCR、免疫印迹结果显示,与PBS对照组比较,Lv-TH-GDNF+rtTA2s-M2+DOX组大鼠纹状体TH、GDNF基因的表达明显增高(P<0.01)。结论慢病毒介导的新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因脑内直接转移,在强力霉素诱导下可减缓6-OHDA诱发的大鼠DA能神经元进行性变性,具有保护作用。 展开更多

关键词 胶质细胞源性神经营养因子 酪氨酸羟化酶 慢病毒 Tet-On系统 活体直接转移 帕金森病

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血管生长素-1基因慢病毒载体的构建及其在间质干细胞的表达 被引量：6

5

作者 陈柏龄 张志坚 +2 位作者 黄东煜 吴秀丽 张彦定 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期1618-1622,共5页

目的:构建带有血管生长素-1(Ang-1)基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)中的表达。方法:RT-PCR获得大鼠Ang-1基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HE... 目的:构建带有血管生长素-1(Ang-1)基因的慢病毒载体并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞(rMSCs)中的表达。方法:RT-PCR获得大鼠Ang-1基因,限制性内切酶酶切和基因重组构建慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES2-EGFP,在脂质体介导下与包装质粒HELPER,包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒颗粒并感染rMSCs。PCR检测Ang-1基因的插入,细胞RT-PCR检测Ang-1mRNA表达,免疫细胞化学和Western blotting检测Ang-1蛋白的表达。结果:所获Ang-1基因经测序证实与GenBank报道的序列一致。慢病毒载体质粒PNL-Ang-1-IRES2-EGFP经SaⅠl和BamHⅠ双酶切后电泳显示1 512 bpAng-1目的基因片段和10.5 kb PNL-IRES2-EGFP载体片段。病毒基因组PCR证实Ang-1基因插入。荧光显微镜观察到EGFP表达。细胞RT-PCR检测到Ang-1mRNA表达。免疫细胞化学和Western blotting检测到Ang-1蛋白表达。结论:成功构建带有Ang-1基因的慢病毒载体并实现在rMSCs中的表达,为Ang-1基因修饰干细胞的应用研究奠定了基础。 展开更多

关键词 间质干细胞 基因 Ang—1

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新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达 被引量：7

6

作者 张阳 张志坚 +3 位作者 杨光华 俞晓岚 黄志新 吴秀丽 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期1079-1084,共6页

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet... 目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。 展开更多

关键词 胶质细胞源性神经营养因子 酪氨酸羟化酶 慢病毒载体 基因克隆 Tet-On系统 可调控表达

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脊髓性肌萎缩症单细胞巢式聚合酶链反应技术的建立及初步应用 被引量：2

7

作者 苏峻峰 陈万金 +4 位作者 吴志英 王柠 林宇 林珉婷 慕容慎行 《中国现代神经疾病杂志》 CAS 2008年第2期129-133,共5页

目的建立单细胞巢式聚合酶链反应技术,并探讨进行脊髓性肌萎缩症基因诊断的可行性,为植入前遗传学诊断奠定基础。方法应用显微操作技术从外周血中分离单个淋巴细胞,制备单细胞DNA模板。分别应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方... 目的建立单细胞巢式聚合酶链反应技术,并探讨进行脊髓性肌萎缩症基因诊断的可行性,为植入前遗传学诊断奠定基础。方法应用显微操作技术从外周血中分离单个淋巴细胞,制备单细胞DNA模板。分别应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法扩增正常对照者外周血中单个淋巴细胞运动神经元生存(SMN)基因第7、8号外显子,计算其阳性率,建立SMN1基因的单细胞巢式聚合酶链反应技术。并应用该项技术及限制性酶切对1例脊髓性肌萎缩症患者进行基因诊断。结果正常对照者巢式聚合酶链反应共扩增60个外周血单个淋巴细胞SMN1基因第7号外显子,其中54个扩增成功,阳性率为90%;引物延伸预扩增共扩增10个外周血单个淋巴细胞,巢式聚合酶链反应分别扩增SMN1基因第7、8号外显子,在20个聚合酶链反应扩增中共有17个单个淋巴细胞扩增成功,阳性率为85%。应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法对1例脊髓性肌萎缩症患者单个淋巴细胞扩增后经限制性酶切显示SMN1基因缺失,结果与全血基因组聚合酶链反应-限制性酶切一致。结论巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增方法各有优缺点,巢式聚合酶链反应耗时短、操作简便,可作为脊髓性肌萎缩症患者单细胞基因诊断的首选方法。 展开更多

关键词 肌萎缩 脊髓性 聚合酶链反应 DNA引物 基因扩增

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EGFP和大鼠GDNF基因共表达的慢病毒载体构建及转染大鼠骨髓间充质干细胞 被引量：3

8

作者 张阳 张志坚 +1 位作者 陈东平 吴秀丽 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期305-311,共7页

为了构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体,观察GDNF基因大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem c... 为了构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体,观察GDNF基因大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSC)的表达,本研究采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从P0大鼠小脑组织中扩增出GDNF基因编码区636 bp的片段,通过限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接,将GDNF插入慢病毒转移载体PNL-IRES2-EGFP,构建PNL-GDNF-IRES2-EGFP。在脂质体介导下将构建成功的慢病毒三质粒系统共转染人胚肾细胞系(293T)包装生产慢病毒,测定病毒滴度。感染rMSCs,荧光显微镜下观察EGFP的表达、转导效率,RT-PCR、Western blot方法分别检测GDNF mRNA和蛋白的表达情况。结果显示:GDNF的基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致,重组慢病毒载体质粒PNL-GDNF-IRES2-EGFP经双酶切鉴定正确;三质粒共转染293T细胞后荧光激发可见大量绿色荧光,收集、浓缩病毒后测定其滴度为5.3×107pfu/ml;感染rMSCs结果显示:GDNF-rMSCs组5 d转导效率为93.3%±3.17%,传代培养4周,下降到81.1%±3.59%,差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR(real time-PCR)、Western blot显示GDNF成功在rMSCs中表达。本结果表明,我们已经成功构建带有EGFP、GDNF基因的慢病毒载体,并获得GDNF-rMSCs基因工程细胞,但提高该工程细胞外源基因的稳定表达技术仍需进一步探讨。 展开更多

关键词 GDNF 慢病毒载体 基因克隆 MSC 转染

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Huntington病两家系基因分析 被引量：3

9

作者 林珉婷 甘世锐 +4 位作者 陈万金 林毅 王柠 吴志英 慕容慎行 《中国现代神经疾病杂志》 CAS 2008年第2期124-128,共5页

目的建立准确而快速的IT15基因胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复序列检测方法,并应用于Huntington病患者的基因诊断及症状前诊断。方法应用聚合酶链反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳及DNA测序技术对Huntington病两家系中的15名成员进行IT15基因CA... 目的建立准确而快速的IT15基因胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复序列检测方法,并应用于Huntington病患者的基因诊断及症状前诊断。方法应用聚合酶链反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳及DNA测序技术对Huntington病两家系中的15名成员进行IT15基因CAG重复数目的检测及分析。结果两家系中共计检出8名成员携带异常的IT15基因,其中2例先证者CAG重复序列存在异常扩增,1例(AⅡ4)出现Huntington病临床表现,其余5例尚未出现Huntington病临床症状与体征。结论IT15基因CAG重复序列的异常扩增是Huntington病的发病基础,应用上述检测方法对IT15基因CAG重复序列进行检测可对Huntington病患者进行准确的基因诊断及症状前诊断。 展开更多

关键词 亨廷顿病 重复序列 核酸 基因 遗传学技术

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磁共振表现为脑干腹侧条带状病变脑膜癌病2例临床分析 被引量：3

10

作者 杨碧晖 许国荣 +1 位作者 王志强 林坤新 《中国神经精神疾病杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期695-700,共6页

本文报告2例罕见的磁共振表现为脑干腹侧条带状异常信号病变的脑膜癌病。例1为49岁女性,因头痛、呕吐、癫痫发作入院,查体示镇静状态,右侧瞳孔直径2.5 mm,对光反应灵敏,左侧瞳孔直径1.5 mm,对光反应迟钝,双眼向右上方凝视,脑膜刺激征阳... 本文报告2例罕见的磁共振表现为脑干腹侧条带状异常信号病变的脑膜癌病。例1为49岁女性,因头痛、呕吐、癫痫发作入院,查体示镇静状态,右侧瞳孔直径2.5 mm,对光反应灵敏,左侧瞳孔直径1.5 mm,对光反应迟钝,双眼向右上方凝视,脑膜刺激征阳性。例2为38岁男性,因反复癫痫发作入院,查体示镇静状态,脑膜刺激征阳性。2例颅脑磁共振成像可见脑干(脑桥、延髓)腹侧表面条带状的钆增强不强化的病变,均于脑脊液中发现恶性肿瘤细胞,确诊脑膜癌病,予抗癫痫、脱水降颅压等治疗,随访2例患者均死亡。通过分析2例具有这种新型影像特征脑膜癌病的临床特征,提高临床上对该病的认识及早期诊断率。 展开更多

关键词 脑膜癌病 软脑膜转移 癌性脑膜炎 磁共振 脑干 肺腺癌

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药物过度使用性头痛的治疗 被引量：5

11

作者 何高铎 张志坚 《中国疼痛医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期763-767,共5页

药物过度使用性头痛(medication overuse headache, MOH)是以慢性头痛和规律过度使用各种镇痛药物为特征的一种疾病。它是一种严重的未成功治疗的头痛,为继发于偏头痛和紧张型头痛的世界第三大头痛。MOH的类型主要依据过度使用镇痛药物... 药物过度使用性头痛(medication overuse headache, MOH)是以慢性头痛和规律过度使用各种镇痛药物为特征的一种疾病。它是一种严重的未成功治疗的头痛,为继发于偏头痛和紧张型头痛的世界第三大头痛。MOH的类型主要依据过度使用镇痛药物的种类、时间及是否伴随共病和复发,可分为简单型和复杂型。MOH病人常合并情绪障碍,如焦虑、抑郁等。目前MOH的程序性治疗步骤主要有:健康教育、戒断治疗、急性期对症治疗、预防性药物治疗、非药物治疗。针对当前MOH的难治性,提倡多层面,更加个体化的治疗。 展开更多

关键词 药物过度使用性头痛 戒药 预防 抑郁 焦虑

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