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布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法的建立与初步验证
1
作者 姚梦欣 彭泽宇 +5 位作者 任文浩 徐艺玫 郭伟 陈创夫 马忠臣 王勇 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第3期255-262,共8页
目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌... 目的 建立灵敏、特异的布鲁氏菌双抗体夹心ELISA检测方法。方法 筛选用于布鲁氏菌检测的单克隆捕获抗体和检测抗体,优化并确定最佳抗体包被时间和浓度,最佳封闭液、封闭时间和阴阳性临界值;通过检验其他易与布鲁氏菌发生交叉反应的细菌来验证该方法的特异性;通过对灭活布鲁氏菌梯度稀释液的检测,验证该方法的灵敏性;将该夹心ELISA检测结果与试管凝集和qPCR检测结果进行比较。结果 筛选出的捕获抗体为4A12,检测抗体为6C12。试验分析显示,捕获抗体4A12的最佳包被浓度为5μg/mL,检测抗体6C12的最佳稀释比为1∶2 000。该研究的最佳包被条件为4℃过夜、5%脱脂奶粉封闭、封闭时间2 h。该研究建立的双抗体夹心ELISA方法只与布鲁氏菌发生反应,与其他细菌未发生反应;布鲁氏菌灭活菌液浓度稀释到1×10^(5) CFU/mL时仍能检测出。批内、批间变异系数均小于10%。结论 该研究成功建立了布鲁氏菌双抗夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性与灵敏性,为布鲁氏菌病的精确诊断和有效防控提供有效途径。 展开更多
关键词 单克隆抗体 布鲁氏菌 双抗夹心ELISA法 诊断
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布鲁氏菌BspG基因缺失对其部分生物学活性影响的研究 被引量：4
2
作者 于水发 马忠臣 +7 位作者 徐艺玫 苗玉和 胡瑞瑞 王震 易继海 李志强 王勇 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期484-489,共6页
为探究布鲁氏菌BspG基因在布鲁氏菌胞内循环感染中的作用,本研究利用PCR方法扩增流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308株BspG基因上、下游同源臂及卡那基因片段,利用融合PCR将上述3个基因片段融合后克隆至pMD19-T载体中构建重组质粒pMD19... 为探究布鲁氏菌BspG基因在布鲁氏菌胞内循环感染中的作用,本研究利用PCR方法扩增流产布鲁氏菌(Brucella abortus)2308株BspG基因上、下游同源臂及卡那基因片段,利用融合PCR将上述3个基因片段融合后克隆至pMD19-T载体中构建重组质粒pMD19-BspG-Kan;同时从B. abortus 2308株中扩增BspG基因并克隆至pBBR1MCS-4载体中,构建重组质粒pBBR1MCS-4-BspG。上述两种质粒均经PCR及测序鉴定。将pMD19-BspGKan电转化至B. abortus 2308株中,24 h后利用Kan筛选BspG基因缺失株(ΔBspG),并经PCR鉴定;将pBBR1MCS-4-BspG转化ΔBspG菌株,经Kan+、AMP+抗性平板筛选BspG基因回补株(pBspG),并经PCR及测序鉴定。将上述两株菌连续传15代后分别利用PCR方法鉴定其的遗传稳定性;通过检测不同培养时间点的OD600nm值并绘制生长曲线分析上述两株菌与亲本菌株的生长特性;按照MOI 100将ΔBspG、pBspG和亲本株分别感染RAW 264.7细胞后不同时间,通过检测细胞内的细菌数量分析各菌株的粘附与侵袭能力(感染后15 min、30 min、45 min、60 min)和胞内生存能力(感染后4 h、8 h、12 h、24 h、48 h)。PCR鉴定结果显示,分别获得了基因缺失株ΔBspG和回补株pBspG且这两株菌分别传至15代后均未出现回复突变现象,表明ΔBspG和pBspG的遗传稳定性均较强;生长曲线结果显示,ΔBspG和pBspG的体外生长趋势明显慢于亲本株;粘附与侵袭力试验结果显示,侵染巨噬细胞1 h内,ΔBspG和pBspG的胞内存活数均与亲本株无显著差异,表明敲除Bsp G不影响细菌的粘附与侵袭能力;侵染巨噬细胞24 h内,ΔBsp G与亲本株的胞内活菌数无显著差异(P>0.05),而24 h后ΔBsp G的胞内活菌数极显著低于亲本株(P<0.01)。本研究结果首次表明BspG基因缺失降低了布鲁氏菌的胞内增殖能力,为研究BspG基因在布鲁氏菌致病机理中的作用奠定基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 BspG 胞内生存
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布鲁氏菌外膜囊泡生物信息学分析及免疫原性评价 被引量：5
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作者 徐朕宇 徐锦凤 +9 位作者 邓肖玉 王月丽 何金科 谢珊珊 王震 易继海 王勇 苗玉和 崔丽瑾 陈创夫 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期2906-2914,共9页
【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态... 【目的】探索布鲁氏菌外膜囊泡(OMVs)在亚单位疫苗上的应用前景,制备布鲁氏菌OMVs亚单位疫苗,评估布鲁氏菌OMVs的免疫原性。【方法】利用高速离心法制备羊种布鲁氏菌OMVs,通过透射电镜、SDS-PAGE和生物信息学分析对制备的OMVs进行形态和组分分析;使用纳米佐剂(LDH)和弗氏佐剂乳化OMVs后免疫小鼠,通过间接ELISA方法检测免疫后7、14、21、28和35 d小鼠血清中的特异性抗体,利用小鼠IgG ELISA检测试剂盒检测免疫后小鼠血清中IgG抗体水平,评估OMVs诱导产生的体液免疫水平;通过小鼠脾脏淋巴细胞分离与细胞因子白细胞介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)测定及小鼠外周血T淋巴细胞亚群的流式细胞术测定评估OMVs免疫小鼠的细胞免疫水平。【结果】成功提取并纯化了布鲁氏菌OMVs,其直径大小为20~160 nm。生物信息学分析结果显示,OMVs主要组成蛋白OMP25、OMP31、OMP16、OMP19、BP26及SOD均属于亲水性蛋白和抗原性蛋白,且存在多个B细胞和T细胞优势抗原表位。与PBS组相比,OMVs免疫小鼠后,不同佐剂组均可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体和IgG抗体(P<0.01);同时OMVs可显著诱导小鼠脾脏淋巴细胞产生IFN-γ(P<0.05),并促进了CD4^(+)T细胞的表达(P<0.05)。【结论】本研究证实了羊种布鲁氏菌OMVs具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫反应,为布鲁氏菌新型亚单位疫苗的开发奠定了理论基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜囊泡(OMVs) 免疫原性
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布鲁氏菌OMP10介导的小鼠骨髓源树突状细胞活化及其对小鼠T细胞增殖影响的研究 被引量：4
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作者 徐朕宇 王月丽 +8 位作者 易继海 童志霞 邓肖玉 杨宁宁 徐明国 王勇 孟闯 苗玉和 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1084-1090,共7页
为探究布鲁氏菌外膜蛋白10(OMP10)介导小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)的活化机制及其对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。本研究通过体外分离培养BMDC细胞6 d后,将重组OMP10(rOMP10)与BMDC共孵育24 h,经流式细胞术分析BMDC表面共刺激分子(CD40、... 为探究布鲁氏菌外膜蛋白10(OMP10)介导小鼠骨髓源性树突状细胞(BMDC)的活化机制及其对小鼠T淋巴细胞增殖的影响。本研究通过体外分离培养BMDC细胞6 d后,将重组OMP10(rOMP10)与BMDC共孵育24 h,经流式细胞术分析BMDC表面共刺激分子(CD40、CD80、CD86)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导细胞表面共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达量显著升高(P<0.001)。同时采用ELISA检测共孵育后BMDC细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-10、IL-4)的表达情况,结果显示,与PBS组相比,rOMP10孵育BMDC能够诱导其细胞因子(IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ)表达量极显著升高(P<0.01),但IL-4和IL-10的表达量极显著降低(P<0.001)。进一步采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测共孵育后BMDC的Toll样受体(TLRs)和MHC-I、MHC-II类分子的mRNA转录水平,结果显示,与PBS组相比,rOMP10能够诱导BMDC的TLR2和TLR4(P<0.05),以及抗原递呈相关分子MHC-I和MHC-II的mRNA转录水平极显著升高(P<0.01)。另外,将小鼠脾脏T淋巴细胞与rOMP10预处理的BMDC共孵育后,经MTT试验检测T淋巴细胞增殖效率,结果显示,rOMP10处理组比PBS组T淋巴细胞的刺激指数增加2倍以上,且在树突状细胞和淋巴细胞比值(DCs:T)为1:50时,rOMP10处理组的T淋巴细胞增殖效率最高。综上所述,本研究首次证实布鲁氏菌OMP10能够诱导BMDC的活化,促进抗原递呈分子的转录,从而介导T淋巴细胞的高效增殖,该结果为解析布鲁氏菌感染与宿主免疫机制奠定实验基础,同时也为布鲁氏菌新型亚单位疫苗研发提供数据支持。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白OMP10 小鼠骨髓源树突状细胞 抗原递呈 T淋巴细胞增殖
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布鲁氏菌重组L7/L12蛋白对小鼠免疫保护效果的评价 被引量：2
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作者 谢珊珊 王月丽 +9 位作者 邓肖玉 席静 于水发 马忠臣 王震 孟闯 苗玉和 徐艺玫 易继海 陈创夫 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期72-78,87,共8页
为探究布鲁氏菌候选保护性抗原L7/L12的免疫原性及其对小鼠的免疫保护效果,本研究经PCR扩增羊种布鲁氏菌16M株L7/L12基因,构建重组质粒pET-22b-L7/L12,经双酶切鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并纯化后利用SDS-PAGE... 为探究布鲁氏菌候选保护性抗原L7/L12的免疫原性及其对小鼠的免疫保护效果,本研究经PCR扩增羊种布鲁氏菌16M株L7/L12基因,构建重组质粒pET-22b-L7/L12,经双酶切鉴定正确后转化E.coli BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达并纯化后利用SDS-PAGE与western blot检测。结果显示,获得了16 ku的重组L7/L12蛋白(rL7/L12),且纯化效果较好。将rL7/L12以100μg/只腹腔注射免疫6周龄SPF BALB/c小鼠,14 d后以50μg/只加强免疫。首免后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d及49 d分别对所有小鼠尾静脉采血,通过间接ELISA方法检测小鼠血清中的IgG抗体、其亚型(IgG1、IgG2a)抗体水平及二者比值;并利用ELISA方法检测首免后21 d和35 d两组小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-10和TNF-α的分泌水平。结果显示,首免后14 d,小鼠血清中IgG抗体水平迅速升高,于首免后21 d达峰值并持续至首免后49 d(P<0.01),对照组小鼠则一直无抗体产生;首免后14 d,rL7/L12组小鼠血清中的IgG1抗体水平极显著高于IgG2a抗体水平(P<0.01),且IgG1/IgG2a大于1;但首免后42 d,rL7/L12组小鼠血清中IgG2a抗体水平极显著高于IgG1(P<0.01),IgG2a/IgG1比值大于1。表明在免疫前期,rL7/L12主要诱导小鼠的Th2型体液免疫反应,免疫后期主要诱导小鼠Th1型细胞免疫反应。首免后21 d和35 d,rL7/L12组小鼠IL-2和TNF-α含量极显著高于PBS对照组(P<0.01),首免后35 d,该组小鼠抑炎因子IL-10的含量极显著低于PBS对照组(P<0.01)。首免后21 d和35 d,分别剖杀每组小鼠,分离小鼠脾淋巴细胞,利用ELISpot法检测各组小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ的分泌水平。结果显示,首免后21 d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的分泌水平有所升高,但与PBS对照组无显著差异(P>0.05);但免疫后35 d,rL7/L12组小鼠脾淋巴细胞IFN-γ分泌水平显著高于PBS对照组(P<0.05)。上述结果表明,rL7/L12免疫后期刺激小鼠机体产生Th1型细胞免疫反应,与抗体检测结果相符。首免后42 d通过腹腔注射途径以100μL(含1×10^(5)cfu/只)的羊种布鲁氏菌新疆流行株043攻击小鼠,攻毒后观察死亡情况,15 d后剖杀全部小鼠,通过检测其脾脏指数及脾脏载菌量(cfu)评价rL7/L12对小鼠的保护效果,结果显示,攻毒后15 d PBS对照组小鼠精神沉郁,但两组小鼠均无死亡;rL7/L12组小鼠的脾指数和脾脏载菌量均显著低于PBS对照组(P<0.05)。本研究结果首次表明,rL7/L12免疫小鼠后能够刺激小鼠的Th2型体液免疫反应和Th1型细胞免疫反应,且以Th1型细胞免疫反应为主。本研究为布鲁氏菌L7/L12亚单位疫苗的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 保护效果 ELISPOT
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