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肿瘤坏死因子受体相关因子6泛素化位点突变载体的构建及其功能位泛素化位点的鉴定
被引量：
5
1
作者
王琴
林春霖
+5 位作者
程志彬
何若凡
林鹏航
陈辉
叶建新
朱广伟
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第3期551-558,共8页
目的:预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因上的泛素化位点,并构建泛素化位点突变质粒,探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)相对荧光素酶活性的影响。方法:采用UbPred、UbiSite和BDM...
目的:预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因上的泛素化位点,并构建泛素化位点突变质粒,探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)相对荧光素酶活性的影响。方法:采用UbPred、UbiSite和BDM-PUB软件预测TRAF6基因的泛素化位点,采用CE Design V1.04软件设计突变引物,采用突变试剂盒进行定点突变,采用PCR法扩增获得突变后的目的片段,扩增产物经Dpnl酶消化,去除甲基化模板质粒,消化产物在ExnaseⅡ催化作用下发生同源重组获得重组质粒;将重组质粒转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒进行DNA测序。采用双荧光素酶报告基因系统检测转染突变质粒后HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性。结果:经过DNA测序,泛素化突变位点已经成功突变,泛素化突变质粒构建成功。与TRAF6野生型基因比较,转染第124、319和331位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低(P<0.05或P<0.01),其中转染第124位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低最明显(P<0.01)。结论:成功构建人TRAF6基因的泛素化突变质粒,TRAF6的第124位氨基酸是其最重要的泛素化位点,可能影响下游信号通路中NF-κB和AP-1的活性。
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关键词
肿瘤坏死因子受体相关因子6
突变质粒构建
泛素化
荧光素酶报告系统
核因子κB
激活蛋白1
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题名
肿瘤坏死因子受体相关因子6泛素化位点突变载体的构建及其功能位泛素化位点的鉴定
被引量：
5
1
作者
王琴
林春霖
程志彬
何若凡
林鹏航
陈辉
叶建新
朱广伟
机构
福建医科大学附属第一医院胃肠外科二区腹部外科研究所
福建医科大学
消化道恶性肿瘤教育部重点实验室
出处
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第3期551-558,共8页
基金
国家自然科学基金项目(81702424,81872364)
福建省科技厅自然科学基金项目(2018J05127)
福建省卫健委中青年骨干项目(2018-ZQN-46)。
文摘
目的:预测人肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)基因上的泛素化位点,并构建泛素化位点突变质粒,探讨突变质粒对人结直肠癌HCT116和SW480细胞中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)相对荧光素酶活性的影响。方法:采用UbPred、UbiSite和BDM-PUB软件预测TRAF6基因的泛素化位点,采用CE Design V1.04软件设计突变引物,采用突变试剂盒进行定点突变,采用PCR法扩增获得突变后的目的片段,扩增产物经Dpnl酶消化,去除甲基化模板质粒,消化产物在ExnaseⅡ催化作用下发生同源重组获得重组质粒;将重组质粒转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒进行DNA测序。采用双荧光素酶报告基因系统检测转染突变质粒后HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性。结果:经过DNA测序,泛素化突变位点已经成功突变,泛素化突变质粒构建成功。与TRAF6野生型基因比较,转染第124、319和331位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低(P<0.05或P<0.01),其中转染第124位突变质粒后,结直肠癌HCT116和SW480细胞中NF-κB和AP-1相对荧光素酶活性降低最明显(P<0.01)。结论:成功构建人TRAF6基因的泛素化突变质粒,TRAF6的第124位氨基酸是其最重要的泛素化位点,可能影响下游信号通路中NF-κB和AP-1的活性。
关键词
肿瘤坏死因子受体相关因子6
突变质粒构建
泛素化
荧光素酶报告系统
核因子κB
激活蛋白1
Keywords
tumor necrosis factor receptor-associated factor 6
mutant plasmid construction
ubiquitination
luciferase reporter system
nuclear factor kappa-B activator protein
分类号
R735.3 [医药卫生—肿瘤]
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出处
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1
肿瘤坏死因子受体相关因子6泛素化位点突变载体的构建及其功能位泛素化位点的鉴定
王琴
林春霖
程志彬
何若凡
林鹏航
陈辉
叶建新
朱广伟
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021
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