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表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒的构建及在Huh7细胞中的表达
被引量：
1
1
作者
王雪萍
李富军
+2 位作者
长野(藤井)基子
北山喜久美
堀田博
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第4期720-723,731,共5页
目的构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A的点突变质粒,并在Huh7细胞中进行表达。方法以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),根据分型标准设计点突变引物。首先构建4个单点突变质粒:pSG5/M-H05-5(A1-2)/4A(A1-2)(Y56F),pSG5/M-H05-5(B1-1)/4A...
目的构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A的点突变质粒,并在Huh7细胞中进行表达。方法以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),根据分型标准设计点突变引物。首先构建4个单点突变质粒:pSG5/M-H05-5(A1-2)/4A(A1-2)(Y56F),pSG5/M-H05-5(B1-1)/4A(B1-1)(L80Q),pSG5/M-H05-5(B2-1)/4A(B2-1)(V51A),pSG5/M-H05-5(B2-2)/4A(B2-2)(S61A)。然后,分别以A1-2,B2-1,B2-2为模板,再将第80位的赖氨酸点突变为谷氨酸(L80Q),构建另外3个双点突变质粒:pSG5/M-H05-5(B1-2)/4A(B1-2),pSG5/M-H05-5(A2-1)/4A(A2-1)和pSG5/M-H05-5(A2-2)/4A(A2-2)。每个质粒均进行序列测定验证点突变成功。用FuGene6转染试剂将构建物转染入Huh7细胞,并应用间接免疫荧光试验和Western blotting检测构建物的表达。结果免疫荧光实验检测到NS3的4种亚细胞定位方式:点状,弥漫样,面包圈样,及短棒状。Western Blotting亦显示构建物均成功表达,同时发现A2-1和B2-1亚型NS3/4A存在不完全切割现象,表明与其他亚型相比,A2-1和B2-1NS3 in cis丝氨酸蛋白酶活性较弱。结论成功构建表达不同氨基端二级结构HCV NS3/4A点突变质粒,为抗不同亚型HCV的深入研究提供基础。
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关键词
pSG5
点突变
HCVNS3/4A
二级结构
Huh
7细胞
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题名
表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒的构建及在Huh7细胞中的表达
被引量：
1
1
作者
王雪萍
李富军
长野(藤井)基子
北山喜久美
堀田博
机构
第四军医
大学
学报编辑部
兰州军区兰州总医院医务部
神户大学大学院医学系研究科微生物学分野
出处
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第4期720-723,731,共5页
基金
日中笹川医学奖学金资助项目(2006~2007年度)
文摘
目的构建表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A的点突变质粒,并在Huh7细胞中进行表达。方法以pSG5/M-H05-5/4A为模板(A1-1),根据分型标准设计点突变引物。首先构建4个单点突变质粒:pSG5/M-H05-5(A1-2)/4A(A1-2)(Y56F),pSG5/M-H05-5(B1-1)/4A(B1-1)(L80Q),pSG5/M-H05-5(B2-1)/4A(B2-1)(V51A),pSG5/M-H05-5(B2-2)/4A(B2-2)(S61A)。然后,分别以A1-2,B2-1,B2-2为模板,再将第80位的赖氨酸点突变为谷氨酸(L80Q),构建另外3个双点突变质粒:pSG5/M-H05-5(B1-2)/4A(B1-2),pSG5/M-H05-5(A2-1)/4A(A2-1)和pSG5/M-H05-5(A2-2)/4A(A2-2)。每个质粒均进行序列测定验证点突变成功。用FuGene6转染试剂将构建物转染入Huh7细胞,并应用间接免疫荧光试验和Western blotting检测构建物的表达。结果免疫荧光实验检测到NS3的4种亚细胞定位方式:点状,弥漫样,面包圈样,及短棒状。Western Blotting亦显示构建物均成功表达,同时发现A2-1和B2-1亚型NS3/4A存在不完全切割现象,表明与其他亚型相比,A2-1和B2-1NS3 in cis丝氨酸蛋白酶活性较弱。结论成功构建表达不同氨基端二级结构HCV NS3/4A点突变质粒,为抗不同亚型HCV的深入研究提供基础。
关键词
pSG5
点突变
HCVNS3/4A
二级结构
Huh
7细胞
Keywords
pSG5
point mutation
HCV NS3/4A
secondary structure
Huh 7 cells
分类号
R346 [医药卫生—基础医学]
R735.7 [医药卫生—肿瘤]
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出处
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1
表达不同氨基端二级结构HCVNS3/4A点突变质粒的构建及在Huh7细胞中的表达
王雪萍
李富军
长野(藤井)基子
北山喜久美
堀田博
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2009
1
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