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NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立
被引量：
2
1
作者
阮婷玉
史唯地
+4 位作者
马勋
王静
康立超
杜冬冬
殷月兰
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第6期1614-1622,共9页
目的:构建N-myc下游调节基因1(NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞(hCMECs)后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。方法:将pGPU6-GFP质粒采用BamHⅠ和BbsⅠ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建...
目的:构建N-myc下游调节基因1(NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞(hCMECs)后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。方法:将pGPU6-GFP质粒采用BamHⅠ和BbsⅠ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。结果:pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序结果显示shRNA均成功连接至pGPU6-GFP载体;荧光显微镜观察载体转染效率约为70%;RT-qPCR法检测,有3个shRNA干扰载体的干扰效果良好,转染后hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平分别约为对照组的26%、21%和13%;Western blotting法检测到对应的特异性蛋白条带,重组质粒pcDNA3.1-NDRG1经双酶切后,电泳结果可见大小为1185和5428 bp的2条DNA条带,测序结果显示NDRG1基因成功插入,成功制备阳性克隆hCMECs。RT-qPCR法检测,阳性克隆hCMEC中NDRG1 mRNA表达水平较对照组升高,约为对照组的25.96倍;Western blotting法检测,hCMEC中NDRG1蛋白表达水平较对照组升高。结论:成功构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体并验证干扰效果;成功构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体和稳定过表达NDRG1的hCMECs。
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关键词
N-myc下游调节基因1
RNA干扰
真核表达载体
过表达
人脑微血管内皮细胞
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题名
NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立
被引量：
2
1
作者
阮婷玉
史唯地
马勋
王静
康立超
杜冬冬
殷月兰
机构
石河子大学动物科技学院预防兽医实验室
新疆农垦科
学院
分析测试中心
江苏省人兽共患病学重点
实验室
出处
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第6期1614-1622,共9页
基金
国家自然科学基金资助项目(31860712,32160833,32160834)
江苏省科技厅人兽共患病学重点实验室资助项目(R1901)
+1 种基金
新疆生产建设兵团科技局省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室开放课题项目(MYSKLKF201905)
新疆生产建设兵团动物疾病防控兵团重点实验室开放课题项目(2020BTDJ05)。
文摘
目的:构建N-myc下游调节基因1(NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞(hCMECs)后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。方法:将pGPU6-GFP质粒采用BamHⅠ和BbsⅠ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。结果:pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序结果显示shRNA均成功连接至pGPU6-GFP载体;荧光显微镜观察载体转染效率约为70%;RT-qPCR法检测,有3个shRNA干扰载体的干扰效果良好,转染后hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平分别约为对照组的26%、21%和13%;Western blotting法检测到对应的特异性蛋白条带,重组质粒pcDNA3.1-NDRG1经双酶切后,电泳结果可见大小为1185和5428 bp的2条DNA条带,测序结果显示NDRG1基因成功插入,成功制备阳性克隆hCMECs。RT-qPCR法检测,阳性克隆hCMEC中NDRG1 mRNA表达水平较对照组升高,约为对照组的25.96倍;Western blotting法检测,hCMEC中NDRG1蛋白表达水平较对照组升高。结论:成功构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体并验证干扰效果;成功构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体和稳定过表达NDRG1的hCMECs。
关键词
N-myc下游调节基因1
RNA干扰
真核表达载体
过表达
人脑微血管内皮细胞
Keywords
N-myc downstream regulated gene 1
RNA interference
Eukaryotic expression vector
Over expression
Human brain microvascular endothelial cells
分类号
R394.2 [医药卫生—医学遗传学]
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出处
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被引量
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1
NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立
阮婷玉
史唯地
马勋
王静
康立超
杜冬冬
殷月兰
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022
2
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