羊口疮病毒新疆流行株的分离鉴定及其遗传进化分析 被引量：11

1

作者 杨海波 孟庆玲 +7 位作者 乔军 才学鹏 贺志昊 刘昱成 彭叶龙 王国超 陈创夫 都曼.努尔坎杰 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第2期14-22,共9页

【目的】研究羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法,检测、分离和鉴定ORFV毒株,对分离... 【目的】研究羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)新疆流行株的遗传变异情况。【方法】采集新疆石河子地区疑似感染ORFV的羔羊唇部结痂病料,通过PCR扩增、Vero传代细胞分离培养、电镜观察、动物回归试验等方法,检测、分离和鉴定ORFV毒株,对分离鉴定的3株ORFV毒株保护性抗原基因B2L和F1L及毒力基因VIR、GIF和VEGF分别进行克隆、测序及遗传进化分析。【结果】从病料中分离鉴定出3株ORFV新疆流行株(ORFV-SHZ1、ORFV-SHZ2和ORFV-SHZ3)。分析结果显示,ORFV分离株保护性抗原基因B2L、F1L相对保守,B2L和F1L基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为88.6%~97.9%和86.7%~97.4%;3个毒力基因的变异相对较大,尤其是VEGF基因。VIR、GIF和VEGF基因编码氨基酸序列与其他参考株的同源性分别为91.8%~97.3%,85.2%~97.0%和71.5%~98.5%。基于B2L和VIR基因的遗传进化树分析表明,ORFV-SHZ1和ORFV-SHZ2分离株均与台湾分离株的亲缘关系最近。【结论】试验分离的ORFV新疆流行株可能是由台湾株与其他毒株重组后产生的,且其毒力基因发生了较大的变异。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 分离鉴定 遗传进化分析 新疆

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单核细胞增生李斯特菌非编码RNA rli87基因缺失株的构建、鉴定及其生长特性初步研究 被引量：5

2

作者 谢堃 乔军 +6 位作者 孟庆玲 彭叶龙 赵海龙 马玉 陈诚 才学鹏 陈创夫 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期998-1003,共6页

拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃... 拟构建单核细胞增生李斯特菌(LM)非编码RNArli87基因缺失株,对其进行分子鉴定,分析rli87基因缺失对LM生长的影响。用融合PCR方法构建LM-SB5 rli87基因缺失突变体,并构建pKSV7-Δrli87穿梭载体,将其转化入LM-SB5感受态细胞,利用温度(42℃)和氯霉素(10μg·mL-1)的抗性双重压力来实现同源重组,筛选同源重组菌进行分子鉴定,测定缺失株与母源野毒株37℃条件下生长曲线。结果显示:PCR和测序结果证实成功获得了LM-Δrli87重组菌。通过25代的连续传代,PCR鉴定结果显示,该缺失株具有良好的遗传稳定性。与野毒株进行对比,在37℃条件下缺失株与野毒株的生长差异不显著(P>0.05)。非编码RNArli87基因在37℃条件下对LM生长没有明显的调控作用。 展开更多

关键词 rli87基因 LM感受态细胞 缺失株 生长特性 同源重组

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单核细胞增生李斯特菌ncRNA rli60基因缺失株的构建研究 被引量：3

3

作者 彭叶龙 乔军 +4 位作者 孟庆玲 谢堃 赵海龙 宋雪梅 陈创夫 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第2期148-152,共5页

为了构建单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)ncRNA rli60基因缺失株,采用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法成功构建具有氯霉素抗性的pKSV7-Δrli60穿梭质粒,然后电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力... 为了构建单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)ncRNA rli60基因缺失株,采用基因重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法成功构建具有氯霉素抗性的pKSV7-Δrli60穿梭质粒,然后电转化至LM-SB5感受态细胞中,在温度和氯霉素的双重选择压力下进行同源重组,通过PCR进行重组菌鉴定。结果表明:成功筛选得到遗传性稳定的LM ncRNA rli60基因缺失株,为揭示LM ncRNA rli60基因功能提供了研究材料;同时,为进一步研究其在LM致病性及环境应激中的分子机制奠定了基础。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯特菌 NCRNA rli60基因 同源重组 重叠延伸PCR

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RNaseⅢ RncS对单核细胞增生李斯特菌毒力的调控作用研究 被引量：2

4

作者 王立霞 孟庆玲 +5 位作者 乔军 蔡扩军 王登峰 郭晶 伍晔晖 才学鹏 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第1期1-7,共7页

核糖核酸酶RnaseⅢ是一种调控nc RNA水平的重要酶系。为了解核糖核酸酶RnaseⅢRncS在单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力中的调控作用,本研究在构建LM-ΔrncS基因缺失突变株的基础上,通过动物感染试验检测强毒株LM-SB5与缺失株LM-Δrnc S对... 核糖核酸酶RnaseⅢ是一种调控nc RNA水平的重要酶系。为了解核糖核酸酶RnaseⅢRncS在单核细胞增生李斯特菌(LM)毒力中的调控作用,本研究在构建LM-ΔrncS基因缺失突变株的基础上,通过动物感染试验检测强毒株LM-SB5与缺失株LM-Δrnc S对昆明系小鼠的LD50、存活能力、脏器载菌量及病理组织学产生的影响;利用细胞侵染试验检测强毒株与缺失株对小鼠巨噬细胞RAW264.7的粘附率、侵袭率及其在胞内生存繁殖能力的影响,分析RnaseⅢRncS对LM毒力的影响。结果显示,LM-SB5强毒株和LM-Δrnc S缺失株对昆明系小鼠的LD50分别为105.60 CFU、106.90 CFU;与LM-SB5强毒株相比,LM-Δrnc S的LD50升高了1.30个对数数量级,小鼠的存活时间明显延长,表明毒力显著降低;第3~5 d肝脏、脾脏载菌量显著减少(P<0.05),其中第4 d差异极显著(P<0.01);LM-Δrnc S缺失株对肝脏、脾脏、肾脏的病理损伤降低;LM-Δrnc S缺失株对RAW264.7细胞的粘附率和侵袭率均显著低于LM-SB5强毒株(P<0.01),在2~6 h之间,LM-Δrnc S缺失株在细胞内的细菌量显著低于LM-SB5强毒株(P<0.05),证实LM-Δrnc S在细胞内的生存增殖能力显著降低,提示rnc S基因对LM毒力发挥有一定的调控作用。本研究为进一步揭示RnaseⅢ在LM毒力中的分子调控机制提供了科学依据。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯特菌 核糖核酸酶RnaseⅢ rncS基因 毒力

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0339基因的原核表达及免疫反应性分析 被引量：2

5

作者 刘来珍 孙志华 +3 位作者 刘娟 史静雪 陈创夫 张辉 《石河子大学学报(自然科学版)》 CAS 2015年第6期716-720,共5页

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339进行了表达纯化、免疫反应性分析,并研究了该蛋白对胚胎滋养层细胞(HPT-8)的细胞因子表达的影响。首先从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0339基因片段,亚克隆至融合表达载体p E... 本研究对布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339进行了表达纯化、免疫反应性分析,并研究了该蛋白对胚胎滋养层细胞(HPT-8)的细胞因子表达的影响。首先从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0339基因片段,亚克隆至融合表达载体p ET-28a,构建表达重组质粒p ET-28a-BMEI0339,并利用大肠杆菌进行表达。Western blotting方法检测其免疫学特性;用纯化的重组蛋白感染细胞,并检测IL-1、IL-10和TNF-α表达量。结果显示:成功构建了p ET-28a-BMEI0339原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BMEI0339蛋白,Western blotting检测其具有免疫反应性,该蛋白作用细胞后发现TNF-α的表达量低于BSA对照组,差异极显著(P<0.01);IL-1和IL-10的表达量差异不显著(P>0.05)。本研究成功表达了布鲁氏菌分泌蛋白BMEI0339,证实其具有一定的免疫原性,表明该蛋白影响了胚胎滋养层细胞TNF-α的表达。本研究为研究布鲁氏菌感染宿主细胞的致病机理提供理论基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMEI0339 原核表达 细胞因子 胚胎滋养层细胞

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275基因的原核表达与鉴定 被引量：1

6

作者 孙志华 张辉 +5 位作者 刘来珍 刘娟 韩玉霞 关团 王浩 陈创夫 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2016年第5期1-7,共7页

【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-... 【目的】克隆布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275的基因并进行诱导表达。【方法】从牛种布鲁氏菌2308株基因组中PCR扩增BPE123和BPE275基因片段,亚克隆到pGEM-T Easy载体中并测序。将BPE123和BPE275基因克隆至融合表达载体pET-28a,构建表达重组质粒pET-28a-BPE123和pET-28aBPE275,在大肠杆菌中进行诱导表达,Western blot分析重组蛋白His-BPE123和His-BPE275的免疫学特性。【结果】PCR扩增获得了462bp的BPE123基因片段和762bp的BPE275基因片段,成功构建了pET-28a-BPE123、pET-28a-BPE275原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BPE123和BPE275蛋白,经SDS-PAGE检测,重组融合蛋白BPE123、BPE275的分子质量分别约为22和31ku,布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别表达的蛋白。【结论】克隆了分泌蛋白BPE123、BPE275基因片段,并成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统效应分子BPE123和BPE275。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 Ⅳ型分泌系统 效应蛋白

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布鲁菌DK63＿426基因缺失株的构建及生物学特性研究 被引量：1

7

作者 李明奇 王小凤 +5 位作者 郭嘉 赵天艺 刘航 张樊 吴长新 张辉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2020年第1期31-36,共6页

目的本研究构建了羊布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株,分析其在细胞内的生存繁殖和致炎能力。方法以羊布鲁菌16M株基因组为模板,利用融合PCR技术将DK 63_426基因的上下游同源臂和卡那抗性基因融合,连接到克隆载体上,通过基因重组构建布鲁... 目的本研究构建了羊布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株,分析其在细胞内的生存繁殖和致炎能力。方法以羊布鲁菌16M株基因组为模板,利用融合PCR技术将DK 63_426基因的上下游同源臂和卡那抗性基因融合,连接到克隆载体上,通过基因重组构建布鲁菌16M DK 63_426基因缺失株16MΔDK 63_426,观察布鲁菌亲本株16M和16MΔDK 63_426的生长变化趋势,建立侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7模型,检测亲本株和缺失株16MΔDK 63_426在胞内的生存能力,检测IL-6、TNF-α细胞因子释放量。结果成功构建了16MΔDK 63_426;在体外相同培养条件下该缺失株与亲本株生长趋势相似,培养12 h即进入对数生长期,30 h进入平台期;16MΔDK 63_426在浸染RAW264.7细胞12 h胞内存活率极显著低于亲本株(P<0.01),在浸染8 h时IL-6的分泌量缺失株组均显著低于亲本株(P<0.05),TNF-α的分泌量缺失株组均显著高于亲本株(P<0.05),在侵染12 h时IL-6的分泌量缺失株组均极显著低于亲本株(P<0.01),TNF-α的分泌量缺失株组均极显著高于亲本株(P<0.01)。结论DK 63_426基因的缺失可影响布鲁菌的胞内存活,影响相关炎症因子的表达,为布鲁菌感染机制的研究奠定理论基础。 展开更多

关键词 布鲁菌 缺失株 脂多糖 DK 63_426基因

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单核细胞增生李斯特菌sRNA伴侣分子hfq的基因克隆、表达及纯化

8

作者 彭叶龙 乔军 +6 位作者 孟庆玲 谢堃 陈诚 刘田莉 马玉 才学鹏 陈创夫 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2014年第5期80-84,共5页

为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a(+)中,成功... 为克隆、表达单核细胞增生李斯特菌sRNA分子伴侣蛋白hfq基因,并纯化重组蛋白,通过PCR的方法从单核细胞增生李斯特菌基因组DNA中扩增出hfq基因,将扩增产物克隆于pMD18-T载体中,测序验证后,再将hfq基因亚克隆至表达载体pET-32a(+)中,成功构建pET-32a(+)-hfq原核表达载体。然后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG进行诱导表达,对表达蛋白进行可溶性分析,并采用Ni-NTA纯化目的蛋白。结果显示:克隆的hfq基因全长234 bp,编码77个氨基酸,通过SDS-PAGE可以检测到27 kDa的蛋白特异性条带;并从上清中纯化得到了Hfq融合蛋白。为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。 展开更多

关键词 单核细胞增生李斯特菌 hfq基因 sRNA伴侣分子 克隆 表达 纯化

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布鲁菌基因缺失株△VceA的感染特征研究

9

作者 刘航 何佳琪 +6 位作者 王小凤 李明奇 郭嘉 赵天艺 张樊 吴长新 张辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2020年第6期68-72,共5页

本文研究了布鲁菌IV型分泌系统效应蛋白VceA缺失对细胞侵染和小鼠感染特征。培养布鲁菌S2308基因缺失突变株ΔVceA,测定ΔVceA在生长过程中的OD值并制作其生长曲线;在用布鲁菌VceA基因缺失株和其亲本株S2308株分别侵染HPT-8细胞后,检测... 本文研究了布鲁菌IV型分泌系统效应蛋白VceA缺失对细胞侵染和小鼠感染特征。培养布鲁菌S2308基因缺失突变株ΔVceA,测定ΔVceA在生长过程中的OD值并制作其生长曲线;在用布鲁菌VceA基因缺失株和其亲本株S2308株分别侵染HPT-8细胞后,检测细胞炎性因子TNF-α和IL-1β的分泌。采用ΔVceA和亲本株S2308分别侵染HPT-8细胞和感染小鼠,对HPT-8进行胞内CFU计数,对小鼠脾脏内进行CFU计数,研究基因缺失突变株ΔVceA的感染特征。结果显示,基因缺失株ΔVceA和亲本株S2308的生长曲线在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;VceA基因缺失株在侵染细胞的初期胞内CFU计数低于亲本株,之后和亲本株无显著差异;基因缺失株ΔVceA在感染小鼠初期脾脏内CFU计数时低于亲本株,在感染后期和亲本株无明显差异;基因缺失株ΔVceA在侵染HPT-8细胞12 h时TNF-α和IL-1β的分泌量缺失株显著低于亲本株。结果表明,VceA基因的缺失不影响布鲁菌的生长繁殖,在布鲁菌感染细胞后影响细胞因子的分泌,胞内外的生存繁殖力明显下降,为深入研究布鲁菌IV型分泌系统的作用和功能奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁菌 VceA 生长曲线 HPT-8细胞

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达及功能分析

10

作者 豆晓霞 刘洋 +5 位作者 李敏 荆明龙 李明奇 王小凤 陈创夫 张辉 《江苏农业科学》 2018年第12期33-38,共6页

为构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达载体,并进行表达、鉴定。从羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M株的基因组中克隆BMEI0742基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-B... 为构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因的原核表达载体,并进行表达、鉴定。从羊种布鲁氏菌(Brucella melitensis)16M株的基因组中克隆BMEI0742基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-BMEI0742利用大肠杆菌进行表达,并进行Western-Blot检测,对该蛋白功能进行生物信息学分析。成功构建了pET-28a-BMEI0742原核表达载体,SDS-PAGE检测结果显示,重组蛋白的分子量约是50 ku,BMEI0742蛋白可与布鲁氏菌阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,不存在信号肽,二级结构以α-螺旋为主并利用Phyre2服务器成功构建了该蛋白的三维模型。本研究成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0742基因,并成功获得了BMEI0742蛋白,该蛋白具有与布鲁氏菌自身蛋白相同的抗原性,为布鲁氏菌翻译延伸因子Tu,为进一步研究其免疫性和保护性以及在布鲁氏菌的致病机制奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMEI0742基因 鉴定 原核表达 反应原性

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因的原核表达

11

作者 刘来珍 孙志华 +3 位作者 刘娟 史静雪 陈创夫 张辉 《草食家畜》 2015年第5期25-30,共6页

【目的】构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因的原核表达载体,并进行免疫原性及其对人胚胎滋养层细胞(HPT-8)细胞因子表达量影响的分析。【方法】本研究从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0580基因片段,亚... 【目的】构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因的原核表达载体,并进行免疫原性及其对人胚胎滋养层细胞(HPT-8)细胞因子表达量影响的分析。【方法】本研究从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI0580基因片段,亚克隆到pMD19-T载体中并测序,克隆至表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-28a-BMEI0580利用大肠杆菌进行表达,并进行Western-Blot检测,ELISA方法检测细胞因子的表达量。【结果】成功构建了pET-28a-BMEI0580原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了BMEI0580基因,经过SDS-PAGE检测,重组蛋白的分子量大约是57kDa,Western-Blot检测其具有免疫特性。【结论】本实验成功表达了布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI0580基因,为进一步研究其免疫性和保护性奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMEI0580基因 原核表达

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白BMEI1069基因的原核表达与分析

12

作者 刘来珍 孙志华 +3 位作者 刘娟 史静雪 陈创夫 张辉 《现代畜牧兽医》 2015年第3期6-11,共6页

为构建布鲁氏菌分泌蛋白BMEI1069基因的原核表达载体,进行分析,分析该蛋白对胚胎滋养层细胞(HPT-8)细胞因子表达量的影响,本研究从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI1069基因片段,亚克隆到p MD19-T载体中并测序,... 为构建布鲁氏菌分泌蛋白BMEI1069基因的原核表达载体,进行分析,分析该蛋白对胚胎滋养层细胞(HPT-8)细胞因子表达量的影响,本研究从羊种布鲁氏菌(B.melitensis)标准株16M的基因组中克隆BMEI1069基因片段,亚克隆到p MD19-T载体中并测序,构建表达重组质粒p ET-28a-BMEI1069。转染大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,采用Western-Blot方法检测其免疫学特性,用纯化的重组蛋白感染细胞,并检测细胞因子含量。结果表明,获得了p ET-28a-BMEI1069原核表达载体,在大肠杆菌中表达了BMEI1069蛋白,经过SDS-PAGE检测,重组蛋白的分子量大约是58 k Da,western blotting检测显示具有免疫特性,细胞加入BMEI1069重组蛋白后细胞因子IL-1、IL-10和TNF-α的表达均高于PBS对照组,差异显著(P<0.05)。本试验成功表达了布鲁氏菌分泌蛋白BMEI1069,证实其有一定的免疫特性,并且重组蛋白可以影响细胞因子的表达。这将为研究分泌蛋白在免疫逃逸和维持持续性感染的机制方面奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BMEI1069 原核表达 细胞因子 胚胎滋养层细胞

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布鲁氏菌vceA基因缺失株的构建及生物学特性研究 被引量：6

13

作者 王小凤 李明奇 +7 位作者 郭嘉 赵天艺 刘航 张樊 孙晓露 何家琪 王震 张辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第4期986-993,共8页

试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进... 试验旨在构建布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统vceA基因缺失株,分析其生长特征及其在人胚胎滋养层细胞(HPT-8)中的存活能力。以布鲁氏菌S2308为模板,PCR扩增vceA基因上、下游同源臂,以pUC19K质粒为模板扩增kan基因,然后利用融合PCR技术将3段基因进行融合,再将此片段与pMD19-T载体连接,电转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,构建ΔvceA基因缺失株(S2308ΔvceA),通过卡那抗性对缺失株进行连续筛选,并检测其遗传稳定性。在相同培养条件下,观察亲本株S2308和S2308ΔvceA的生长变化趋势,以侵染复数(MOI)100∶1侵染HPT-8细胞,通过CFU计数检测亲本株S2308和缺失株S2308ΔvceA在细胞内的生存能力。结果显示,试验成功获得片段大小为372、510、1 093 bp的vceA基因上、下游同源臂和kan基因;且成功构建pMD19-T-vceA-kan自杀载体,将其电转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建基因缺失株,连续传代10次未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,缺失株S2308ΔvceA与亲本株S2308生长趋势相似,均在12 h达到对数生长期,30 h进入平台期;侵染HPT-8细胞12 h时,缺失株S2308ΔvceA在细胞中的数量显著低于亲本株S2308(P<0.05)。综上所述,本试验成功构建并获得了具有良好遗传稳定性的布鲁氏菌vceA基因缺失株,该缺失株在体外培养条件下与亲本株生长趋势相似;但该缺失株在HPT-8细胞内的存活能力显著变弱。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 vceA基因缺失株 生长曲线 生物学特性

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布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统蛋白基因VceA的原核表达、纯化及功能分析 被引量：3

14

作者 史静雪 刘来珍 +5 位作者 李敏 荆明龙 刘洋 张豫 刘航 张辉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2017年第1期83-88,共6页

本研究对布鲁氏菌分泌蛋白VceA基因进行了原核表达与纯化,并分析其反应原性,致炎特性和分子特性。应用PCR技术从布鲁氏菌2308基因组中扩增VceA基因,亚克隆至PMD19-T载体后,进行测序,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-VceA,然后转化至E.coli BL... 本研究对布鲁氏菌分泌蛋白VceA基因进行了原核表达与纯化,并分析其反应原性,致炎特性和分子特性。应用PCR技术从布鲁氏菌2308基因组中扩增VceA基因,亚克隆至PMD19-T载体后,进行测序,构建重组表达质粒PGEX-4T-1-VceA,然后转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中,IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,Western Blot检测其反应原性;用重组蛋白作用于细胞,检测炎症相关细胞因子的分泌量;并对该蛋白进行生物信息学分析。结果显示:PCR扩增出VceA基因,SDS-PAGE显示纯化的VceA融合蛋白大约在37 kD处,Western Blot也出现了杂交带。细胞实验表明重组蛋白刺激细胞后产生的IL-18,IL-1β,TGF-β1的含量均显著高于BSA对照组(P<0.05)。生物信息学分析显示,该蛋白无跨膜区结构,存在信号肽,属于分泌型蛋白,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,并利用Phyre2软件成功构建了该蛋白的三维模型。结果表明,成功克隆并表达了布鲁氏菌Vce A蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,并具有致炎作用。这为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白的致病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 Ⅳ型分泌系统 VceA基因 细胞因子

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牛种布鲁氏菌2308参考株Δ VceC基因缺失株的构建与鉴定 被引量：2

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作者 李敏 史静雪 +4 位作者 李志强 荆明龙 刘洋 陈创夫 张辉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2017年第6期714-719,共6页

为了研究布鲁氏菌四型分泌系统VceC蛋白的功能,构建牛种布鲁氏菌2308参考株△vceC的基因突变株,本研究以牛种布鲁氏菌参考株2308的分泌蛋白VceC为研究对象,以牛种布鲁氏菌参考株基因组为模板,高保真(pfu酶)扩增VceC基因的上下游同源臂基... 为了研究布鲁氏菌四型分泌系统VceC蛋白的功能,构建牛种布鲁氏菌2308参考株△vceC的基因突变株,本研究以牛种布鲁氏菌参考株2308的分泌蛋白VceC为研究对象,以牛种布鲁氏菌参考株基因组为模板,高保真(pfu酶)扩增VceC基因的上下游同源臂基因;以卡那抗性基因质粒为模板高保真扩增卡那抗性基因,运用融合PCR将上下游同源臂和卡那抗性基因融合,用TA克隆的方法将融合片段连接到克隆载体上,再用电转化的方法将载体转入布鲁氏菌2308感受态细胞中,最后用卡那抗性筛选并检测其遗传稳定性。将亲本株2308缺失株2308△VceC在相同起始浓度下震荡培养,观察其生长变化趋势;侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8),比较其在胞内的生存能力。结果显示:利用T载体克隆和抗性替换的方法成功构建了2308的VceC的突变株,与亲本株相比,2308△VceC在体外培养生长趋势与亲本株相似,在12 h时进入对数生长期,30 h时进入平台期,胞内CFU显示侵染12 h后缺失株胞内细菌数量明显下降,亲本株2308和2308-Δ VceC缺失突变株在12 h时差异显著。本研究为布鲁氏菌Ⅳ型分泌系统的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 vceC基因 同源重组 稳定遗传

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