羊种布鲁氏菌新疆流行株015株sodc基因缺失株的构建与初步评价 被引量：6

1

作者 易德武 张俊波 +5 位作者 王远志 李默 李爽 张欢 王杰 陈创夫 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2016年第1期24-29,共6页

为了构建布鲁氏菌015 sodc基因缺失株,本研究采用PCR方法以热灭活的羊种布鲁氏菌新疆流行株015为模板,分别扩增sodc基因的上下游同源臂序列;以枯草芽孢杆菌为模板,扩增Sac B基因,将扩增序列分别连至克隆载体p MD19-T simple上并测序,然... 为了构建布鲁氏菌015 sodc基因缺失株,本研究采用PCR方法以热灭活的羊种布鲁氏菌新疆流行株015为模板,分别扩增sodc基因的上下游同源臂序列;以枯草芽孢杆菌为模板,扩增Sac B基因,将扩增序列分别连至克隆载体p MD19-T simple上并测序,然后在双酶切后将上下游同源臂序列连接至自杀载体p GEM-7Zf+上,分别得到了p GEM-7zf-Δsodc,再将Sac B基因单酶切后连接至上述载体上,构建成同源重组自杀质粒pss。经8%蔗糖平板筛选鉴定Sac B基因的活性。将构建好的自杀质粒分别电转化至布鲁氏菌015感受态细胞中,通过氨苄抗性筛选和8%蔗糖敏感筛选后获得了015Δsodc基因缺失株。对获得的基因缺失株进行PCR鉴定和遗传稳定性检测。通过检测侵染小鼠巨噬细胞cfu、缺失株免疫小鼠后体内Ig G,IFN-γ的水平,及脾脏cfu,对其毒力进行了初步评价。结果表明,该缺失株20代内未发生回复性突变,成功构建了具有非抗性基因标记的缺失株,并且015Δsodc细胞cfu、脾脏cfu,及IFN-γ的水平都显著低与亲本株015,说明毒力与亲本株相比有一定程度的下降。本研究可为今后布鲁氏菌致病机理及新疫苗的研究提供实验材料。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 sodc基因 缺失株

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布鲁氏菌M5-90ΔWboA基因缺失株的构建及免疫效果的初步评价 被引量：10

2

作者 张艳 陈创夫 +5 位作者 张辉 张沾 李志强 张俊波 孟仁 王震 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期546-551,共6页

为获得毒力较弱并能区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究用PCR方法扩增WboA基因的上下游同源臂序列,构建重组质粒pGEM-7zf-Δ WboA-Sac,电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选布鲁氏菌疫苗株M5-90的WboA基因缺失株,并对获... 为获得毒力较弱并能区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌候选疫苗株,本研究用PCR方法扩增WboA基因的上下游同源臂序列,构建重组质粒pGEM-7zf-Δ WboA-Sac,电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选布鲁氏菌疫苗株M5-90的WboA基因缺失株,并对获得的M5-90Δ WboA遗传稳定性、毒力、免疫保护性、抗体水平等指标进行检测。实验结果表明M5-90Δ WboA株的毒力比M5-90株明显减弱,差异极显著(p<0.01),体液免疫和细胞免疫结果表明M5-90Δ WboA株与亲本M5-90株相比差异不显著(p<0.05),M5-90Δ WboA株和亲本株的保护率分别为10%和20%,表明M5-90Δ WboA株与M5-90株具有相似的保护性。凝集试验和western blot试验显示M5-90Δ WboA株免疫小鼠的血清反应结果为阴性。本研究构建的布鲁氏菌基因缺失株M5-90Δ WboA具有较好的遗传稳定性,毒力比亲本株更弱,免疫保护性与亲本株相当,并能以血清学检测方法区分野毒株感染和缺失疫苗株免疫的动物。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 WboA 基因 同源重组 免疫原性

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布鲁氏菌外膜蛋白VirB4在感染胚胎滋养层细胞中的作用分析 被引量：5

3

作者 孙志华 刘良波 +6 位作者 张豫 刘娟 韩玉霞 刘来珍 郭乾 陈创夫 张辉 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期990-996,共7页

目的筛选布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞过程中与Ⅳ型分泌系统VirB4蛋白结合的潜在靶蛋白。方法设计引物并PCR扩增布鲁氏菌的virB4基因,构建表达载体pGBKT7-VirB4,酶切鉴定,测序分析正确后,转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187,进行自激活和毒... 目的筛选布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞过程中与Ⅳ型分泌系统VirB4蛋白结合的潜在靶蛋白。方法设计引物并PCR扩增布鲁氏菌的virB4基因,构建表达载体pGBKT7-VirB4,酶切鉴定,测序分析正确后,转化酿酒酵母菌感受态细胞Y187,进行自激活和毒性检测;建立布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞模型,构建布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;采用酵母双杂交技术筛选与VirB4相互作用的滋养层细胞蛋白,实时定量PCR检测靶蛋白表达量的变化。结果成功构建了pGBKT7-virB4诱饵质粒,转入Y187后无毒性,不能自激活;获得了布鲁氏菌侵染牛胚胎滋养层细胞cDNA文库;筛选到了13个阳性质粒,其中蛋白辅酶Q10和SLC3A2在布鲁氏菌侵染后mRNA表达量均增加。结论本试验对VirB4蛋白与宿主细胞的互作研究为进一步阐明布鲁氏菌感染宿主细胞的发病机制奠定了基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 VirB4 CDNA文库 酵母双杂交 MRNA

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牛源耐药性金黄色葡萄球菌的分离鉴定及黏附因子基因FnBP和clfA的表达分析 被引量：5

4

作者 孙志华 刘君 +4 位作者 张辉 刘娟 许长萌 张华雷 陈创夫 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期22-28,共7页

为探究致奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的生物学特性,对新疆垦区部分奶牛场乳房炎奶样进行病原学分析,并对病原菌进行耐药性、毒力因子的表达分析。从乳房炎奶样中分离得到S.aureus,采用血浆凝... 为探究致奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)的生物学特性,对新疆垦区部分奶牛场乳房炎奶样进行病原学分析,并对病原菌进行耐药性、毒力因子的表达分析。从乳房炎奶样中分离得到S.aureus,采用血浆凝固酶试验、KB法、琼脂筛选法、生化鉴定法(VITEK32)、聚合酶链式反应等法进行鉴定。针对毒力基因clfA(凝集因子A)和FnBP(纤维结合素结合蛋白)进行特异性PCR扩增,用T/A克隆法将其插入pMD18-T载体,并构建原核表达载体pET-28a(+)-FnBP和pET-28a(+)-clfA。转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定表达产物。常规鉴定出葡萄球菌105株,其中金黄色葡萄球菌(S.aureus)62株,从62株S.aureus中检出耐药性金黄色葡萄球菌(MRSA)13株,检出率为20.10%,2株未确检。经测序证实与GenBank中FnBP基因(J04151)和clfA基因(AB245457)序列同源性分别为100%和95.69%。SDS-PAGE显示,clfA和FnBP蛋白相对分子质量分别为45ku和58ku。Western blot分析显示,clfA蛋白和FnBP蛋白均可与金黄色葡萄球菌多克隆抗血清发生特异性反应。病畜奶样中MRSA检出率较高,新疆垦区部分牛场呈蔓延趋势,成功表达了clfA、FnBP蛋白,具有一定的免疫保护效果。 展开更多

关键词 奶牛乳房炎 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 凝集因子A基因 纤维结合素结合蛋白基因

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布鲁氏菌WboA基因的原核表达与鉴定 被引量：7

5

作者 张艳 陈创夫 +5 位作者 张辉 张沾 陈瑞花 张钰 李志强 张俊波 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2011年第2期189-192,共4页

为了在大肠杆菌中表达布鲁氏菌的WboA蛋白,并对其进行纯化和鉴定,采用PCR方法扩增得到WboA基因DNA片段,将其克隆于pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-WboA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进... 为了在大肠杆菌中表达布鲁氏菌的WboA蛋白,并对其进行纯化和鉴定,采用PCR方法扩增得到WboA基因DNA片段,将其克隆于pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-WboA,转化E.coliBL21,IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行Western blot鉴定及测序。结果显示:重组表达质粒pET-WboA经双酶切及测序鉴定证明构建正确。经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE、western blot分析鉴定,可见约45 ku的外源蛋白带,表明WboA基因在大肠杆菌中得到了表达。用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的WboA蛋白。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 WboA基因 原核表达

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布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶基因的原核表达与鉴定 被引量：5

6

作者 张豫 张辉 +5 位作者 张艳 陈瑞花 王震 桂丹 孙志华 陈创夫 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2013年第1期35-38,共4页

对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;... 对布鲁氏菌磷酸葡萄糖变位酶(pgm)蛋白进行了表达与纯化,为研究该基因的功能提供了物质基础。首先利用PCR方法从羊种布鲁氏菌基因组DNA中PCR法扩增pgm基因,并将该基因亚克隆至pET-28a(+)载体中,转化入大肠杆菌(DE3),诱导表达融合蛋白;表达产物经Ni-NTA Agarose亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示:扩增了pgm的全基因,成功构建了布鲁氏菌pgm基因的原核表达载体pET-28a(+)-pgm,并且在大肠杆菌中进行了表达,经Western blot鉴定,该蛋白可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应,且具有良好的免疫反应性。本研究为进一步研究布鲁氏菌pgm蛋白的生物学功能提供基础物质,也为进一步开发基因工程疫苗提供理论基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 pgm基因 原核表达

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布鲁氏菌感染诱发巨噬细胞炎症反应的初步研究 被引量：3

7

作者 刘娟 孙志华 +4 位作者 张静 张豫 刘来珍 李明奇 张辉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2015年第4期438-442,共5页

为研究NLRP3炎症小体在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞过程中活化介导的炎症反应,建立牛种布鲁氏菌2308株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,侵染比例100∶1(细菌∶细胞),RT-PCR技术检测细菌侵染过程中NLRP3炎症小体相关分子NLRP3和Caspase-1 m... 为研究NLRP3炎症小体在布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞过程中活化介导的炎症反应,建立牛种布鲁氏菌2308株侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,侵染比例100∶1(细菌∶细胞),RT-PCR技术检测细菌侵染过程中NLRP3炎症小体相关分子NLRP3和Caspase-1 m RNA的变化水平;Western blot分析NLRP3和Caspase-1在蛋白水平的变化;ELISA检测感染细胞上清中炎症因子IL-18和IL-1β的释放量。结果表明:与对照组相比布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞后NLRP3和Caspase-1 m RNA和蛋白表达水平显著增加(P<0.05),炎性因子IL-1β和IL-18的含量也显著升高(P<0.05)。结论:布鲁氏菌感染可激活NLRP3炎症小体,为进一步研究布鲁氏菌感染引发致病机制奠定理论基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 RAW264.7巨噬细胞 炎症小体 NLRP3

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结核分枝杆菌CFP10基因真核表达质粒的构建及表达 被引量：1

8

作者 李跃峰 张俊波 +5 位作者 监通 贺志锐 王讲德 张辉 陈创夫 曹旭东 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期878-881,共4页

为研究结核杆菌毒力因子CFP10在结核杆菌感染细胞过程中的功能,本研究根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的CFP10基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到CFP10基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测... 为研究结核杆菌毒力因子CFP10在结核杆菌感染细胞过程中的功能,本研究根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的CFP10基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到CFP10基因DNA片段。将扩增片段克隆于pGM18-T载体中,测序验证后,再将CFP10基因亚克隆至pEGFP-N1中,经核苷酸序列测定和酶切鉴定获得重组表达质粒pEGFP-N1-CFP10,分别转染293T细胞和U937细胞。经western blot分析表明CFP10-EGFP融合蛋白在293T细胞和U937细胞中均获得了表达。通过激光共聚焦显微镜观察显示在293T细胞和U937细胞,CFP10-EGFP融合蛋白主要分布于细胞质。本研究为进一步研究毒力因子CFP10在感染宿主细胞中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 结核病 CFP10 ESAT6

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绵羊嗜皮菌病间接免疫酶标组织化学检测方法的建立 被引量：1

9

作者 王静梅 韩文星 +1 位作者 齐亚银 剡根强 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2008年第3期307-310,共4页

为建立一种用于绵羊刚果嗜皮菌病的免疫酶标组化法,采用兔抗刚果嗜皮菌抗体及羊抗兔HRP抗体,对2只人工感染刚果嗜皮菌的绵羊病变皮肤切片进行了免疫酶标组化检测,并与分离培养、PCR方法进行比较,结果显示2只人工感染绵羊皮肤病料均为阳... 为建立一种用于绵羊刚果嗜皮菌病的免疫酶标组化法,采用兔抗刚果嗜皮菌抗体及羊抗兔HRP抗体,对2只人工感染刚果嗜皮菌的绵羊病变皮肤切片进行了免疫酶标组化检测,并与分离培养、PCR方法进行比较,结果显示2只人工感染绵羊皮肤病料均为阳性,与PCR、分离培养及刚果嗜皮菌阳性对照符合率为100%;而健康绵羊皮肤切片、大肠杆菌、肠球菌阴性对照涂片均为阴性。建立的免疫酶组化方法可用于检测绵羊刚果嗜皮菌,且具有特异性强,操作简便等特点。 展开更多

关键词 绵羊嗜皮菌病 免疫酶标组织化学技术

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FTH1在布鲁氏菌侵染宿主细胞中的作用

10

作者 孙志华 杜军伟 +5 位作者 刘娟 许长萌 韩玉霞 关团 陈创夫 张辉 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第2期158-163,共6页

为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞... 为了探究布鲁氏菌侵染宿主巨噬细胞过程中铁蛋白(FTH1)生物学功能,本研究根据FTH1蛋白核苷酸序列,分别设计4条特异性小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ ZsGreen载体,并转染RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR筛选干扰效果最优的质粒;布鲁氏菌侵染干扰前、后的RAW264.7巨噬细胞,实时定量PCR检测布鲁氏菌基因16S rRNA和细胞凋亡相关基因的mRNA表达量。结果显示:获得了4条特异性siRNA分子,经测序正确,pSIREN-C siRNA质粒对FTH1干扰效果最高可达98%。干扰后布鲁氏菌侵染抑制率为84%,凋亡相关基因的mRNA表达量5个降低,3个上升。本研究表明:FTH1基因沉默后布鲁氏菌胞内的生存能力下降;布鲁氏菌侵染可以抑制细胞凋亡发生,FTH1基因沉默后细胞凋亡升高。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 FTH1 巨噬细胞 凋亡

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布鲁氏菌043强毒株BR0524基因缺失突变株的构建与毒力的初步评价 被引量：9

11

作者 纪太旺 张辉 +6 位作者 郭飞 张科 李志强 王震 赵庆亮 王浩 陈创夫 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2014年第5期529-535,共7页

为研究BR0524基因对羊种布鲁氏菌043毒力的影响,本研究利用同源重组的原理,以BR0524基因外侧的同源臂序列构建重组质粒,将其电转化至布鲁氏菌043感受态细胞,通过卡那抗性筛选和检测引物鉴定之后进而获得羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突... 为研究BR0524基因对羊种布鲁氏菌043毒力的影响,本研究利用同源重组的原理,以BR0524基因外侧的同源臂序列构建重组质粒,将其电转化至布鲁氏菌043感受态细胞,通过卡那抗性筛选和检测引物鉴定之后进而获得羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株,且该缺失突变株在15代内未发生回复性突变,遗传性稳定。将羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株、羊种布鲁氏菌043和M5以106 CFU剂量腹腔接种小鼠,进行体内感染试验,并以布鲁氏菌与小鼠巨噬细胞为100∶1的感染比例侵染小鼠巨噬细胞RAW264.7。结果表明:与羊种布鲁氏菌043相比,羊种布鲁氏菌043-ΔBR0524缺失突变株的载菌量几乎没有下降(P<0.05),对小鼠脾脏重量变化的影响也趋于相似(P<0.05);侵染小鼠巨噬细胞试验结果与动物感染试验结果也趋于一致(P<0.05),这表明BR0524基因的缺失不会对羊种布鲁氏菌043毒力功能的发挥产生显著的影响。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 BR0524基因 毒力 同源重组

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