基于TMT技术的牦牛妊娠期血清蛋白质组学分析 被引量：1

1

作者 姚颖 周应聪 +7 位作者 杜培岩 李一娟 钱文洁 李柳杨 余志鹏 崔燕 余四九 樊江峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期192-206,共15页

为了探究妊娠期内牦牛血清的蛋白质组特征,筛选并分析差异表达蛋白质(DEPs)在牦牛妊娠维持中的作用。本研究选择9头4岁半至6岁龄健康状况良好且当年未产犊的自然发情母牦牛进行人工授精(AI)。在AI后第30、60及90天采集其血清样品,并对... 为了探究妊娠期内牦牛血清的蛋白质组特征,筛选并分析差异表达蛋白质(DEPs)在牦牛妊娠维持中的作用。本研究选择9头4岁半至6岁龄健康状况良好且当年未产犊的自然发情母牦牛进行人工授精(AI)。在AI后第30、60及90天采集其血清样品,并对授配母牦牛进行妊娠诊断。依据诊断结果将采集的样品进行回顾性分组,即妊娠第1、2、3月组及未妊娠组(未妊娠组样品来自AI后90天经妊娠诊断确诊为未孕的牦牛个体),每组样品3个生物学重复。利用串联质谱标签(TMT)技术对牦牛血清样品的蛋白表达情况进行定量分析,筛选差异表达蛋白,并对其进行GO功能富集和KEGG通路等生物信息学分析,进一步筛选与牦牛妊娠维持相关的潜在蛋白。结果显示,在4组牦牛血清蛋白样品中共获得497个蛋白,以差异倍数≥1.2或≤0.83,且P<0.05为条件筛选,共筛选到68个差异蛋白。GO功能富集和KEGG通路分析显示,这些DEPs在代谢、免疫系统、粘附、生物调节等生物学过程以及补体与凝血级联、金黄色葡萄球菌感染等与炎症和免疫途径相关的通路有明显富集。值得注意的是,妊娠期各组间差异蛋白富集通路中均包含有PI3K-Akt、Rap1、MAPK等与生殖相关的信号通路。DEPs中IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4、AZGP1的表达具有随妊娠时间的延长而连续上调的趋势,且这些蛋白在妊娠第3月表达量显著高于未妊娠状态。研究结果表明,牦牛妊娠早期存在明显的血清蛋白组的变化。这些DEPs分别在促进细胞粘附与增殖、母胎血管生成、维持母体代谢与免疫平衡等过程中起到重要作用。尤其是IGFBP2、FGG、B2M、PDIA4、AZGP1可能通过参与调节胎盘生长发育、免疫应答和脂质代谢等过程,在牦牛妊娠维持中发挥着重要作用。研究结果为进一步探明牦牛维持妊娠过程的调控机制提供了基础资料。 展开更多

关键词 TMT 蛋白质组学 牦牛 血清 差异表达蛋白 妊娠维持

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Oct 4在牦牛卵母细胞及早期胚胎发育过程中的表达 被引量：11

2

作者 赵天 李谷月 +5 位作者 潘阳阳 李月琴 陈平 温泽星 崔燕 余四九 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期577-584,共8页

旨在通过检测转录因子Oct 4(Octamer-binding transcription factor 4)在牦牛(Bos grunneins)卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的表达,分析Oct 4在卵母细胞与体外受精胚胎发育过程中的作用。本研究收集牦牛卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus... 旨在通过检测转录因子Oct 4(Octamer-binding transcription factor 4)在牦牛(Bos grunneins)卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的表达,分析Oct 4在卵母细胞与体外受精胚胎发育过程中的作用。本研究收集牦牛卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)对其进行体外成熟培养,生产体外受精(In vitro fertilization,IVF)胚胎,评估各时期胚胎发育能力。采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和间接免疫荧光染色方法从基因和蛋白水平检测COCs和胚胎各时期Oct 4的表达与分布。结果表明,1)2~4-细胞胚胎、5~8-细胞胚胎、9~16-细胞胚胎和囊胚的发育率分别为(64.66±1.76)%、(43.33±1.76)%、(24.66±2.40)%和(9.33±0.67)%。2)COCs和胚胎各发育时期均可检测到Oct 4基因,其中9~16-细胞胚胎表达最高,依次为囊胚、2~4-细胞胚胎和5~8-细胞胚胎,未成熟COCs和成熟COCs中表达最低。3)免疫荧光染色结果显示,OCT 4蛋白主要分布在COCs和体外受精胚胎的细胞质中,在细胞核中表达较弱。免疫荧光IOD值分析可得,9~16-细胞胚胎IOD值最高,依次为囊胚、2~4-细胞胚胎,5~8-细胞胚胎最低。综上表明,Oct 4在牦牛卵母细胞和早期胚胎发育过程中的各个时期均有表达,且不同时期该基因的表达量存在差异。由此说明Oct 4在9~16-细胞胚胎时期可能参与胚胎合子型基因转录激活的调控过程,在囊胚时期可能参与维持内细胞团全能性的过程。 展开更多

关键词 OCT 4 牦牛 体外受精 胚胎发育

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EGF对牦牛冻精运动性能、细胞凋亡和IVF胚胎发育潜力的影响 被引量：7

3

作者 潘阳阳 王萌 +2 位作者 余四九 崔燕 何俊峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期854-862,共9页

本研究旨在探明牦牛冻精体外获能过程中,EGF是否调控精子的细胞凋亡、运动性能及其对后续胚胎发育的影响。在牦牛冻精体外获能过程中,加入不同浓度EGF(0、50、75、100、150和200ng·mL-1),应用精子分析仪分析不同处理组精子活性;运... 本研究旨在探明牦牛冻精体外获能过程中,EGF是否调控精子的细胞凋亡、运动性能及其对后续胚胎发育的影响。在牦牛冻精体外获能过程中,加入不同浓度EGF(0、50、75、100、150和200ng·mL-1),应用精子分析仪分析不同处理组精子活性;运用qRT-RCR、Western blot检测Bax和Bcl-2的表达;评估IVF后受精胚的发育能力。结果表明:1)EGF可显著提高牦牛冻精运动性能、胚胎卵裂率(P<0.05),且这种调控具有一定的浓度依赖性。2)75~150ng·mL^(-1) EGF可以显著提高获能冻精Bcl-2基因和蛋白表达,降低Bax表达(P<0.05)。综上表明,牦牛冻精体外获能过程中,EGF不仅降低牦牛冷冻精子的细胞凋亡和提高牦牛精子运动性能,而且能够提高IVF后胚胎发育潜力,且其最佳作用浓度为75~150ng·mL^(-1)。本研究为通过生长因子作用提高牦牛体外胚胎生产提供重要参考信息。 展开更多

关键词 EGF 牦牛 精子 胚胎 细胞凋亡

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Caspase-9在肉用绵羊主要生殖器官中的分布研究

4

作者 张涛杰 崔燕 +3 位作者 余四九 樊江峰 刘犇 郑凯 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1526-1531,共6页

通过试验研究凋亡因子Caspase-9在肉用绵羊主要生殖器官中的表达,并探讨其生理意义。利用免疫组织化学的方法对Caspase-9在肉用绵羊主要生殖器官中的表达进行研究。研究结果显示,Caspase-9只在细胞质中表达,其在卵巢中主要分布于原始卵... 通过试验研究凋亡因子Caspase-9在肉用绵羊主要生殖器官中的表达,并探讨其生理意义。利用免疫组织化学的方法对Caspase-9在肉用绵羊主要生殖器官中的表达进行研究。研究结果显示,Caspase-9只在细胞质中表达,其在卵巢中主要分布于原始卵泡、初级卵泡及颗粒性黄体细胞,而卵泡膜性黄体细胞中未见表达;黄体期,主要表达于子宫的浅层腺体腺上皮细胞、子宫内膜上皮细胞、子宫颈黏膜固有层的淋巴小结、输卵管黏膜上皮分泌细胞和纤毛细胞、峡部的浆液性腺的腺上皮细胞;卵泡期,子宫和输卵管各个部位阳性反应不明显。在正常生理情况下,Caspase-9参与了肉用绵羊主要生殖器官周期性变化的调控和子宫黏膜免疫,对生殖器官功能的稳定发挥起着重要作用。 展开更多

关键词 细胞凋亡 CASPASE-9 免疫组织化学 生殖器官 肉用绵羊

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TNF-α对牦牛卵母细胞HIF-1α和HSP70的表达及后续胚胎发育能力的影响 被引量：2

5

作者 许涛 潘阳阳 +5 位作者 何翃闳 李谷月 张慧珠 赵凌 崔燕 余四九 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1198-1207,共10页

旨在研究肿瘤坏死因子(TNF-α)对牦牛卵母细胞体外成熟和对低氧诱导因子1α(HIF-1α)、热休克蛋白70(HSP70)的表达以及后续胚胎发育能力的影响。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的TNF-α(最终浓度分别为0、10、25、50 ng
... 旨在研究肿瘤坏死因子(TNF-α)对牦牛卵母细胞体外成熟和对低氧诱导因子1α(HIF-1α)、热休克蛋白70(HSP70)的表达以及后续胚胎发育能力的影响。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度的TNF-α(最终浓度分别为0、10、25、50 ng·mL^-1),牦牛卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)培养成熟后,统计其卵母细胞成熟率及体外受精后早期胚胎的发育率,采用RT-PCR扩增牦牛 HIF-1α、 HSP 70基因,采用实时荧光定量PCR(qRT-RCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)和免疫荧光染色技术检测HIF-1α、HSP70在基因和蛋白水平的表达情况。结果发现:1)成熟液中加入TNF-α,卵母细胞的成熟率提高,且随着TNF-α浓度的升高,卵母细胞的成熟率、卵裂率和囊胚率逐渐升高,当TNF-α浓度为 25 ng·mL^-1 时,卵母细胞的成熟率和卵裂率达到最高,分别为84.98%和66.85%,而囊胚率也达到了21.48%,均显著高于对照组( P <0.05);2)随着TNF-α浓度的升高, HIF-1α的表达量逐渐降低,对照组 HIF-1α的表达量极显著高于其他组(P <0.01),50 ng·mL^-1 TNF-α组 HIF-1α的表达量极显著低于其他组(P <0.01),HIF-1α在卵丘细胞和卵母细胞上均有表达;3)25 ng·mL^-1 TNF-α组的HSP 70表达量最高,极显著高于其他组(P <0.01),而当TNF-α达到50 ng·mL^-1 时,HSP 70的表达量最低。综上表明,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,TNF-α明显提高了卵母细胞的发育能力,同时还诱导了HSP 70的表达,抑制了HIF-1α的表达,为今后探讨TNF-α、 HIF-1α和HSP70在牦牛生殖过程中发挥的作用以及对胚胎发育的影响提供理论依据。 展开更多

关键词 牦牛 卵母细胞 肿瘤坏死因子(TNF-α) 低氧诱导因子1α(HIF-1α) 热休克蛋白70(HSP70) 表达

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促红细胞生成素对牦牛肾间质成纤维细胞凋亡因子表达的影响

6

作者 卢增华 崔燕 +6 位作者 余四九 白雪峰 卢鸿琴 何俊峰 卢凯 翟国亮 祁正满 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3460-3471,共12页

旨在探讨促红细胞生成素(EPO)对牦牛肾间质成纤维细胞(RIFs)中凋亡因子的影响。本研究首先分别采集3头4岁龄的健康牦牛和黄牛的肾脏组织,采用免疫组织化学方法和Western blot检测牦牛和黄牛肾脏中EPO的准确分布及其表达量。同时对牦牛R... 旨在探讨促红细胞生成素(EPO)对牦牛肾间质成纤维细胞(RIFs)中凋亡因子的影响。本研究首先分别采集3头4岁龄的健康牦牛和黄牛的肾脏组织,采用免疫组织化学方法和Western blot检测牦牛和黄牛肾脏中EPO的准确分布及其表达量。同时对牦牛RIFs进行原代培养鉴定,并对其进行不同药物处理来调控RIFs中EPO表达水平,检测EPO对凋亡相关基因Bax,Bcl-2,PCNA在mRNA和蛋白表达水平的影响。免疫组化学检测结果显示,EPO在牦牛和黄牛肾脏中集合管上皮细胞、肾小管上皮细胞和小管周间质成纤维样细胞中均呈阳性表达。qRT-PCR和Western blot结果显示,EPO在牦牛肾脏中的表达量显著高于黄牛(P<0.001)。随后对生成EPO的RIFs进行原代培养并调控EPO的表达,结果表明:激活组显著升高RIFs中Bcl-2和PCNA的表达,降低Bax的表达(P<0.001)。EPO抑制组显著降低RIFs中Bcl-2、PCNA的表达,上调Bax的表达(P<0.001)。综上表明,EPO在牦牛和黄牛肾脏中集合管上皮细胞、肾小管上皮细胞和小管周间质成纤维样细胞中均呈阳性表达,牦牛肾脏中的EPO高表达能够促进RIFs中Bcl-2和PCNA的表达,并降低Bax的表达,说明EPO可以在牦牛肾脏中起到抗凋亡的作用。 展开更多

关键词 牦牛 促红细胞生成素(EPO) 肾间质成纤维细胞(RIFs) 凋亡

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FSH、LH对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及E_2、P分泌功能的影响 被引量：14

7

作者 徐庚全 樊江峰 +3 位作者 杨世华 李谷月 赵华山 余四九 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期932-939,共8页

为了探明促卵泡素(Follicle stimulating hormone,FSH)和促黄体素(Luteinizing hormone,LH)对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及甾体激素分泌的影响,揭示促性腺激素调控卵泡发育的机理,采用细胞培养和显微观察技术,建立了牦牛卵泡颗粒... 为了探明促卵泡素(Follicle stimulating hormone,FSH)和促黄体素(Luteinizing hormone,LH)对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及甾体激素分泌的影响,揭示促性腺激素调控卵泡发育的机理,采用细胞培养和显微观察技术,建立了牦牛卵泡颗粒细胞体外培养体系,观察分析牦牛卵泡颗粒细胞体外培养的生长特征和凋亡的形态特征;采用流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)和放射免疫测定技术(Radioimmunoassay,RIA),分析了添加不同浓度的FSH和LH对牦牛卵泡颗粒细胞凋亡和雌二醇(Estradiol,E2)、孕酮(Progesterone,P)分泌的影响。结果显示,体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞呈现出典型的上皮样细胞生长特性,具有典型的'S'形生长曲线,体外培养的牦牛颗粒细胞偶尔可见细胞核浓缩、边集化、染色质固缩、内质网疏松等凋亡的形态特征。在添加0.050~5.000IU·mL-1FSH,随着浓度的增加,凋亡细胞比例逐渐降低,E2和P水平呈上升趋势;在添加浓度达到5.000IU·mL-1时,凋亡细胞比例最低降到7.3%,与对照组差异极显著(P<0.01)。低浓度的LH(0.050~0.500IU·mL-1),可以抑制颗粒细胞凋亡,促使E2和P分泌增加;高浓度的LH(5.000IU·mL-1)则促使颗粒细胞凋亡,对颗粒细胞分泌E2和P的影响不明显。这一结果表明,FSH和LH可通过调节牦牛颗粒细胞的凋亡及分泌功能,在调控卵泡发育及排卵的过程中发挥重要作用。 展开更多

关键词 牦牛 促性腺激素 颗粒细胞 细胞凋亡 激素分泌

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表皮生长因子对牦牛卵丘细胞低氧诱导因子-1α表达的影响及与凋亡的关联性分析 被引量：5

8

作者 张译夫 潘阳阳 +1 位作者 温泽星 余四九 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1154-1161,共8页

旨在研究EGF是否通过调控HIF-1α抑制牦牛卵丘细胞凋亡。本研究在牦牛卵丘细胞体外培养时加入不同浓度的EGF,运用qRT-PCR和免疫荧光技术检测HIF-1α、Bcl-2和Bax的表达,用一步法TUNEL检测不同处理组卵丘细胞的凋亡情况。结果表明:(1)牦... 旨在研究EGF是否通过调控HIF-1α抑制牦牛卵丘细胞凋亡。本研究在牦牛卵丘细胞体外培养时加入不同浓度的EGF,运用qRT-PCR和免疫荧光技术检测HIF-1α、Bcl-2和Bax的表达,用一步法TUNEL检测不同处理组卵丘细胞的凋亡情况。结果表明:(1)牦牛卵丘细胞体外培养液中添加不同浓度的EGF后,卵丘细胞HIF-1α和Bax mRNA的相对表达量降低,Bcl-2 mRNA的相对表达量增加,且具有浓度依赖性;当EGF浓度为50ng·mL^(-1)时,HIF-1α和Bax mRNA的相对表达量最低,Bcl-2mRNA的相对表达量最高。(2)向其体外培养液中添加不同浓度的EGF后,卵丘细胞HIF-1α和Bax蛋白的相对表达量降低,Bcl-2蛋白的相对表达量增加,且具有浓度依赖性;当EGF浓度为50ng·mL^(-1)时,HIF-1α和Bax蛋白的相对表达量最低,Bcl-2蛋白的相对表达量最高。(3)TUNEL凋亡检测表明,对照组中卵丘细胞凋亡率最高,当EGF浓度为25ng·mL^(-1)时,细胞凋亡率显著降低(P<0.05);当EGF浓度为50ng·mL^(-1)时,细胞凋亡率最低(P<0.05),但随着EGF浓度的增加,卵丘细胞的凋亡率又升高。本研究结果表明,EGF可通过调控HIF-1α抑制卵丘细胞凋亡,其作用可能与线粒体介导的Bax和Bcl-2凋亡途径相关。 展开更多

关键词 表皮生长因子(EGF) 低氧诱导因子-1α(HIF-1α) 凋亡 卵丘细胞 牦牛

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CYP19A1调控内源性雌激素合成促进牦牛COCs细胞自噬和早期发育能力 被引量：5

9

作者 王立斌 王萌 +6 位作者 孙莹 陈睿 张甜甜 黄振华 张倩 余四九 潘阳阳 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期4283-4295,共13页

旨在探索牦牛卵母细胞成熟过程中细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450arom,CYP19A1)对内源性雌激素(17β-estradiol,E_(2))分泌、卵母细胞自噬和后续胚胎发育能力的影响。本研究在牦牛卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,CO... 旨在探索牦牛卵母细胞成熟过程中细胞色素P450芳香化酶(cytochrome P450arom,CYP19A1)对内源性雌激素(17β-estradiol,E_(2))分泌、卵母细胞自噬和后续胚胎发育能力的影响。本研究在牦牛卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)体外成熟过程中,分别用等体积生理盐水、最佳浓度E_(2)(10^(-7)mol·L^(-1))、CYP19A1诱导剂黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)、CYP19A1抑制剂双酚A(bisphenol A,BPA)处理,实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)、Western blot和免疫荧光技术检测各组成熟COCs中CYP19A1表达水平,酶联免疫吸附方法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测诱导和抑制CYP19A1处理组牦牛成熟COCs培养液中E_(2)水平;分析不同处理组COCs细胞自噬调控关键因子:自噬相关基因5(autophagy related gene 5,ATG5)、微管相关蛋白轻链3(microtubule associated protein light chain 3,LC3)和Bcl-2同源结构域蛋白(Bcl-2 homologous domain protein,BECLIN1)表达,比较不同处理组卵母细胞成熟率、孤雌激活胚胎卵裂率、以卵裂胚胎数为基数的囊胚率。结果显示,AFB1处理组COCs中CYP19A1的表达水平上调,内源性E_(2)分泌增加,自噬相关因子ATG5、BECLIN1和LC3表达水平增加,且与对照组差异均显著(P<0.05);E_(2)处理组CYP19A1水平显著降低,但COCs细胞自噬相关因子表达水平显著升高(P<0.05);BPA处理组CYP19A1的表达显著下调,内源性E_(2)和COCs细胞自噬相关因子均显著降低(P<0.05);与对照组相比,卵母细胞成熟率与胚胎卵裂率在E_(2)和AFB1处理组显著增加(P<0.05),而在BPA处理组显著降低(P<0.05),以卵裂胚胎数为基数的囊胚率在各组间差异不显著(P>0.05)。研究表明,牦牛COCs成熟过程中CYP19A1上调内源性E_(2)水平,其上调的E_(2)与外源性E_(2)生理功能具有相似性,均可诱导细胞自噬发生,提升早期卵母细胞发育能力,结果为深入探索生殖激素调控哺乳动物卵母细胞成熟的分子机制提供了理论依据。 展开更多

关键词 雌激素 细胞自噬 细胞色素酶 卵母细胞成熟 胚胎发育

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牦牛Fas和FasL基因克隆及其在主要组织器官中的表达 被引量：3

10

作者 樊江峰 陈鹏 +1 位作者 崔燕 余四九 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期228-238,共11页

为了进一步理解Fas/FasL系统,本研究拟克隆牦牛Fas和FasL基因,并对2个基因在各组织器官中的表达进行检测。采用RT-PCR方法克隆牦牛Fas和FasL基因,并利用相关软件进行生物信息学分析,结合RTPCR方法及免疫组织化学方法对2个基因在牦牛主... 为了进一步理解Fas/FasL系统,本研究拟克隆牦牛Fas和FasL基因,并对2个基因在各组织器官中的表达进行检测。采用RT-PCR方法克隆牦牛Fas和FasL基因,并利用相关软件进行生物信息学分析,结合RTPCR方法及免疫组织化学方法对2个基因在牦牛主要组织器官中的表达进行检测。克隆得到了2 605bp的牦牛Fas基因cDNA和1 572bp的FasL基因cDNA序列,与黄牛的相应序列有很高的同源性(分别为99.1%和99.4%)。除了在心中只检测到Fas mRNA外,Fas和FasL mRNA共同表达于所有检测的组织中,且2个基因均在肝、脾、肾、淋巴结、胸腺和睾丸中强表达。免疫组化检测发现FasL蛋白存在于多种体细胞的胞浆中。结果表明,除了在淋巴器官和免疫赦免位点外,Fas和FasL还强表达于其他器官如肾和肝,表明Fas/FasL系统比以前所了解的要复杂。 展开更多

关键词 FAS FASL 基因克隆 表达 牦牛

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低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响 被引量：6

11

作者 白雪峰 崔燕 +3 位作者 余四九 李慧 何俊峰 廖博 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期620-629,共10页

本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理(DMOG组)和不做药物处理(对照组),检测EMT相关基因在mRNA和蛋白... 本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理(DMOG组)和不做药物处理(对照组),检测EMT相关基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,并观察细胞形态变化。结果表明:使用Ⅰ+Ⅱ型胶原酶可以更好地获得肾小管上皮细胞;免疫荧光结果细胞CK18表达呈阳性,Vimentin和CD31呈阴性表达;qRT-PCR和Western blot结果表明,DMOG组中的HIF-1α,TGF-β1,α-SMA在mRNA和蛋白水平均较对照组有极显著增加(P<0.01),而E-cadherin的表达显著降低(P<0.05);经药物干预后,细胞形态由铺路石样转变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞。本研究成功建立了牦牛肾小管上皮细胞的分离培养体系,并发现HIF-1α表达上调可以促进牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化。 展开更多

关键词 牦牛 肾小管上皮细胞 分离培养 HIF-1Α 上皮-间质转化

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成年牦牛皮肤中血管与神经的组织学观察及HIF-1α在皮肤中的表达 被引量：5

12

作者 任钰昕 崔燕 +4 位作者 邹胜南 白雪峰 余四九 何俊峰 廖博 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2633-2641,共9页

本研究旨在探讨牦牛不同部位皮肤内血管和神经的分布情况,及检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在不同部位皮肤上的定位及相对表达量,探究牦牛皮肤对高原低氧环境的适应机制。采用HE、Masson’s三色和Verhoeff VG染色法,对成年牦牛皮肤内血... 本研究旨在探讨牦牛不同部位皮肤内血管和神经的分布情况,及检测低氧诱导因子-1α(HIF-1α)在不同部位皮肤上的定位及相对表达量,探究牦牛皮肤对高原低氧环境的适应机制。采用HE、Masson’s三色和Verhoeff VG染色法,对成年牦牛皮肤内血管和神经结构进行观察与分析;采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法,对HIF-1α的mRNA和蛋白在成年牦牛皮肤组织中表达与分布进行研究。结果表明,颈部血管与神经密度最高,前臂部和小腿部次之,跖部最低,部位间差异显著(P<0.05)。HIF-1α主要表达在表皮层、毛囊的上皮根鞘、皮脂腺、汗腺、血管、神经;颈部、前臂部和小腿部强阳性表达,跖部阳性表达。HIF-1αmRNA的相对表达量跖部明显低于其他部位(P<0.05),其他三个部位两两比较差异不显著(P>0.05)。HIF-1α蛋白相对表达量颈部最高,跖部最低,差异显著(P<0.05)。研究结果提示,成年牦牛不同部位皮肤内不同血管和神经形态结构相似,密度从颈部到前肢再到后肢差异显著。HIF-1α的差异性表达进一步说明皮肤在牦牛适应低氧环境中发挥作用。 展开更多

关键词 牦牛 皮肤 血管 神经 HIF-1Α

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牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用 被引量：2

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作者 焦正兴 潘阳阳 +7 位作者 王萌 王靖雷 马文斌 高翔 张晖 崔燕 余四九 王立斌 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第6期2436-2447,共12页

旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC 3B基因序列,利用原核表达... 旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B(microtubule associated protein 1 light chain 3B,LC3B)基因,制备牦牛LC3B多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础。本研究通过基因克隆方法获得牦牛LC 3B基因序列,利用原核表达、亲和层析法纯化牦牛LC3B重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,Sepharose4B柱层析法纯化制备牦牛LC3B多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(WB)、免疫组织化学法(IHC)和免疫荧光技术(IF)检测牦牛生殖器官中LC3B蛋白的表达。结果显示,本研究成功克隆了牦牛LC 3B基因(登录号:OP572227),构建的重组质粒pET-32a-LC3B能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛LC3B重组蛋白大小为34 ku(含Trx和His标签),符合预期结果。通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛LC3B蛋白血清,抗体效价分别为1∶640000和1∶320000,特异性良好,表明牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备成功。纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中LC3B的表达检测,LC3B在牦牛卵巢、输卵管和子宫中表达,并且能识别LC3B-Ⅰ和发生脂化后的LC3B-Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周。本研究通过成功克隆牦牛LC 3B基因制备了牦牛LC3B多克隆抗体,使用抗体检测发现LC3B蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛LC3B蛋白的检测和细胞自噬水平的研究。 展开更多

关键词 牦牛 LC3B 原核表达 多克隆抗体 生殖

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幼年牦牛不同部位皮肤毛囊的组织学结构及TGF-β2与HIF-1α差异性表达分析 被引量：4

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作者 张虔 崔燕 +6 位作者 余四九 廖博 邹胜南 白雪峰 SethYawAfedo 赵鹏飞 龙敏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期3224-3233,共10页

旨在探究幼年牦牛皮肤毛囊的组织学结构和TGF-β2及HIF-1α对幼年牦牛皮肤毛囊生长发育的影响,选取10头健康幼年牦牛,采集其颈部、背部、胸部、腹部、小腿部、腋下及阴囊皮肤组织,制作石蜡切片后,采用HE和Sacpic染色,对各部位皮肤组织... 旨在探究幼年牦牛皮肤毛囊的组织学结构和TGF-β2及HIF-1α对幼年牦牛皮肤毛囊生长发育的影响,选取10头健康幼年牦牛,采集其颈部、背部、胸部、腹部、小腿部、腋下及阴囊皮肤组织,制作石蜡切片后,采用HE和Sacpic染色,对各部位皮肤组织中毛囊进行观察和计数,并筛选出多毛及少毛部位。利用qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学法对TGF-β2和HIF-1α在幼年牦牛多毛皮肤和少毛皮肤进行定位与定量的初步研究。结果表明,幼年牦牛皮肤的毛囊分布于真皮层,常与汗腺及皮脂腺伴行,毛髓质及内根鞘结构不完整。Sacpic染色可见毛囊内根鞘为红色,外根鞘为苍绿色,结缔组织鞘为蓝绿色。腹部皮肤的毛囊数量最多[(2085±15)个·cm-2],阴囊数量最少[(158±15)个·cm-2]。免疫组织化学结果显示,TGF-β2及HIF-1α主要表达在表皮层、毛囊外根鞘、皮脂腺及汗腺。TGF-β2在阴囊和腋下的mRNA转录水平和蛋白质表达水平均显著高于腹部和背部。HIF-1α在腹部的mRNA转录水平和蛋白质表达水平均显著高于其他三个部位。幼年牦牛的毛囊处于退行期,在腹部数量最多,背部次之,阴囊最少;TGF-β2和HIF-1α在不同部位皮肤中的表达水平存在显著差异,为进一步研究TGF-β2和HIF-1α对牦牛皮肤毛囊生长发育的影响提供理论依据。 展开更多

关键词 幼年牦牛 多毛皮肤 少毛皮肤 TGF-Β2 HIF-1Α

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INHβB、FSHR和LHR在牦牛不同生殖生理阶段卵巢组织中的表达及差异性分析 被引量：2

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作者 王军乾 赵凌 +7 位作者 潘阳阳 王萌 龙亚丽 高泽川 马文斌 钟董兰 余四九 王立斌 《动物医学进展》 北大核心 2022年第7期51-56,共6页

为了从受体角度研究抑制素(INH)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)对牦牛不同生殖生理阶段卵巢发挥的功能,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白印迹技术(Western blot)和免疫组织化学技术(IHC)检测抑制素受体(INHβB)、促卵泡素受体(FSHR)... 为了从受体角度研究抑制素(INH)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)对牦牛不同生殖生理阶段卵巢发挥的功能,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白印迹技术(Western blot)和免疫组织化学技术(IHC)检测抑制素受体(INHβB)、促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在牦牛发情期、间情期和妊娠期卵巢组织中的表达和定位。结果显示,INHβB在妊娠期牦牛卵巢组织中的表达量显著高于发情期和间情期(P<0.05),而FSHR在发情期的表达量显著高于间情期和妊娠期(P<0.05),LHR则在间情期的表达量显著高于发情期和妊娠期(P<0.05);这3个受体主要分布在卵泡颗粒细胞、卵丘细胞、黄体细胞和卵泡膜上。结果表明,INHβB、FSHR和LHR在牦牛发情期、间情期、妊娠期卵巢组织中均有表达,但其表达量存在一定差异,提示INH、FSH和LH在牦牛不同阶段对卵泡生长发育、卵泡成熟、排卵及黄体的形成发挥着不同的作用,该结果为进一步研究牦牛生殖活动中INH与FSH、LH的互作机制提供参考。 展开更多

关键词 牦牛 抑制素受体 促卵泡素受体 促黄体素受体 卵巢

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牦牛睾丸发育过程中INHβB、FSHR和LHR的表达差异性分析 被引量：2

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作者 龙亚丽 王军乾 +7 位作者 潘阳阳 王萌 赵凌 马文斌 张虔 王靖雷 余四九 王立斌 《动物医学进展》 北大核心 2022年第12期43-49,共7页

为进一步研究抑制素(INH)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)在牦牛精子形成过程中发挥的作用,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹技术(WB)和免疫组织化学法(IHC)检测抑制素受体(INHβB)、促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR... 为进一步研究抑制素(INH)、促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)在牦牛精子形成过程中发挥的作用,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹技术(WB)和免疫组织化学法(IHC)检测抑制素受体(INHβB)、促卵泡素受体(FSHR)和促黄体素受体(LHR)在不同年龄牦牛睾丸中的表达及定位。结果显示,INHβB、FSHR和LHR在不同年龄牦牛睾丸组织中均有表达,其相对表达量随年龄增长呈现先上升后下降的趋势;5岁时表达量最高,并显著高于其他3个年龄段(P<0.05)。INHβB、FSHR和LHR蛋白主要分布在睾丸组织的各级生精细胞、支持细胞及间质细胞中。结果表明,牦牛睾丸发育过程中INHβB、FSHR和LHR均可介导相应激素调控精子的生成与成熟,为进一步探索牦牛睾丸的发育及精子的生成提供了研究基础。 展开更多

关键词 牦牛 睾丸 抑制素受体 促卵泡素受体 促黄体素受体

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肺离子细胞相关蛋白ATP6V0D2在不同年龄牦牛肺内分布和表达 被引量：1

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作者 魏雅婷 崔燕 +1 位作者 张倩 何俊峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期1765-1768,共4页

本研究旨在揭示肺离子细胞相关蛋白ATP6V0D2在不同年龄组牦牛肺中的分布和表达特点,探索ATP6V0D2在牦牛肺适应高原低氧环境中的结构形成和可能调控作用。利用免疫组织化学,qRT-PCR和Western blot对初生、幼年、成年和老年4个年龄组牦牛... 本研究旨在揭示肺离子细胞相关蛋白ATP6V0D2在不同年龄组牦牛肺中的分布和表达特点,探索ATP6V0D2在牦牛肺适应高原低氧环境中的结构形成和可能调控作用。利用免疫组织化学,qRT-PCR和Western blot对初生、幼年、成年和老年4个年龄组牦牛肺中ATP6V0D2的准确分布位置及相对表达量进行研究。结果显示,ATP6V0D2主要分布在肺内支气管及其分支的管壁上皮黏膜层的纤毛细胞和克拉拉细胞中;在成年组和老年组呈强阳性表达,ATP 6V0D2在不同年龄组牦牛肺中均有不同程度的表达,以初生组表达量最高,与其他3组相比较,差异性显著(P<0.05)。在蛋白水平上,ATP6V0D2在成年组中的表达量显著高于其他3组(P<0.05);初生组、幼年组、老年组两两相比较,差异性均显著(P<0.05)。ATP6V0D2在不同年龄牦牛肺细支气管上皮细胞中均有表达,但不同年龄组间的表达存在显著差异(P<0.05)。肺离子细胞相关蛋白ATP6V0D2表达量的不同与牦牛肺对低氧环境的适应性过程有关,纤毛细胞和克拉拉细胞与肺离子细胞的功能具有相关性,在牦牛肺适应高原低氧环境、防止气道损伤或修复过程方面发挥重要作用。 展开更多

关键词 牦牛 肺 肺离子细胞 ATP6V0D2

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FSH对牦牛卵母细胞EGF、EGFR表达及其细胞凋亡的影响 被引量：11

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作者 何翃闳 潘阳阳 +5 位作者 张慧珠 李秦 王萌 崔燕 樊江峰 余四九 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期1899-1907,共9页

旨在研究促卵泡素(FSH)对牦牛卵母细胞体外成熟,以及对表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)的表达影响和与细胞凋亡的关系。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度FSH(终浓度分别为0、2、5、10μg·mL^(-1)),体外成熟... 旨在研究促卵泡素(FSH)对牦牛卵母细胞体外成熟,以及对表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)的表达影响和与细胞凋亡的关系。在牦牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同浓度FSH(终浓度分别为0、2、5、10μg·mL^(-1)),体外成熟培养后,运用实时荧光定量PCR(qRT-RCR)和免疫荧光染色技术检测EGF、EGFR表达情况,采用qRT-RCR和蛋白免疫印迹法检测Bax、Bcl-2表达变化。结果表明:1)成熟培养液中加入FSH可提高COCs成熟率,当成熟液中FSH为5μg·mL^(-1)时,成熟率最高,达到76.84%,显著高于其他组(P<0.05);2)随着FSH浓度的增加,EGF和EGFR表达逐渐升高,其中在5μg·mL^(-1) FSH组中,EGF和EGFR的表达最高,显著高于其他组(P<0.05),而在10μg·mL^(-1)FSH组中,EGF和EGFR的表达水平降低;EGF主要位于卵丘细胞中,而EGFR在卵丘细胞和卵母细胞均有表达;3)随着FSH浓度的增加,Bax和Bcl-2的表达显示出明显的逆向模式,Bax的表达水平逐渐降低,Bcl-2的表达水平逐渐升高,在5μg·mL^(-1) FSH组中Bax的表达量最低,Bcl-2的表达量最高,而在10μg·mL^(-1)FSH组中,Bax的表达水平升高。综上表明,在牦牛卵母细胞体外成熟过程中,FSH提高了卵母细胞发育能力,诱导EGF和EGFR表达,而且可能通过调控Bax、Bcl-2等凋亡相关因子的表达,抑制卵母细胞凋亡。 展开更多

关键词 牦牛 卵母细胞 促卵泡素 表皮生长因子(EGF) 表皮生长因子受体(EGFR) 细胞凋亡

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整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达与定位 被引量：5

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作者 杨珊珊 何翃闳 +8 位作者 潘阳阳 段宏伟 刘敏清 高泽川 赵凌 韩小红 王亚营 崔燕 余四九 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2710-2719,共10页

旨在探究整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位的表达差异,为进一步了解整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期健康母牦牛(3~6岁)的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品,将卵泡期、黄体期和... 旨在探究整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位的表达差异,为进一步了解整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期健康母牦牛(3~6岁)的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品,将卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western-blotting,WB)检测整合素αv基因和蛋白的表达情况,运用免疫组织化学法检测整合素αv的定位。结果表明:1)qRT-PCR结果显示,在卵泡期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部(P<0.01);在黄体期,整合素αv基因在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部(P<0.01);在妊娠期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部(P<0.01)。2)Western-blotting结果显示,在卵泡期,整合素αv蛋白在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部(P<0.01);在黄体期,整合素αv蛋白在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部(P<0.01);在妊娠期,整合素αv蛋白在输卵管峡部和伞部的表达差异不显著,但二者极显著高于壶腹部(P<0.01)。3)免疫组织化学结果显示,整合素αv主要分布于输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中。结果显示,整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达存在显著差异,说明其可能参与了牦牛受精及早期胚胎发育等一系列生殖过程,为牦牛的繁殖性能研究提供了基础资料。 展开更多

关键词 整合素ΑV 牦牛 输卵管 繁殖周期 表达

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Enpp2基因的分子特征及其在雌性牦牛不同繁殖阶段生殖器官中的表达 被引量：6

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作者 马文斌 王萌 +7 位作者 潘阳阳 王靖雷 张燕燕 高丽青 张晖 王军乾 余四九 王立斌 《动物医学进展》 北大核心 2022年第1期58-64,共7页

为了探讨胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(Enpp2)基因在母牦牛不同繁殖阶段生殖器官中的表达与定位,对Enpp2基因进行克隆,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学法检测ENPP2在母牦牛生殖器官中的表达与... 为了探讨胞外焦磷酸酶/磷酸酯酶2(Enpp2)基因在母牦牛不同繁殖阶段生殖器官中的表达与定位,对Enpp2基因进行克隆,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)和免疫组织化学法检测ENPP2在母牦牛生殖器官中的表达与定位。结果显示,Enpp2基因ORF全长2669 bp,共编码875个氨基酸,表现为高度保守且种属间存在差异性;ENPP2蛋白是一种不稳定的可溶性蛋白,有信号肽。ENPP2在雌性牦牛生殖器官均有表达,其中在卵巢上,妊娠期的相对表达量显著高于卵泡期和黄体期(P<0.05);在输卵管上,黄体期最高,妊娠期最低(P<0.05);在子宫上,妊娠期显著低于卵泡期和黄体期(P<0.05)。免疫组化结果显示,ENPP2主要定位在黄体细胞、卵泡膜和卵泡颗粒层、输卵管黏膜上皮以及子宫内膜和子宫腺上。研究结果可为探究牦牛生殖生理提供理论基础。 展开更多

关键词 牦牛 ENPP2 卵巢 输卵管 子宫

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