为进一步阐明脱落的分子机理,采用SMART(switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术,在酵母菌株Y187中构建番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库。以中蔬6号番茄花柄为试材,选取其不同脱落阶段的离区,提取总RNA,利...为进一步阐明脱落的分子机理,采用SMART(switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术,在酵母菌株Y187中构建番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库。以中蔬6号番茄花柄为试材,选取其不同脱落阶段的离区,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与载体pGADT7-Rec共转化入酵母菌Y187感受态中,在缺少亮氨酸的培养基(SD-Leu with agar)上培养收集所有克隆。经鉴定,cDNA文库的转化效率为5.6×10~6cfu·μg^(-1),文库容量为2.4×10~7cfu,文库滴度为4.9×10~8cfu·mL^(-1),平均插入片段长度大于1000bp,重组率为100%。随机挑取20个单克隆测序,比对NCBI数据库分析获得了19个已知蛋白序列和1个未知蛋白序列。已知功能的序列编码的蛋白分为4类,包括酶类蛋白、转录因子、载体蛋白和逆境响应蛋白,参与蛋白质磷酸化、水分运输和氧化还原反应等生物过程,其中7个序列之前被报道参与脱落。结果表明获得该文库质量较高,为筛选番茄花柄脱落过程中的互作蛋白奠定了基础。展开更多
文摘为进一步阐明脱落的分子机理,采用SMART(switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)技术,在酵母菌株Y187中构建番茄花柄脱落过程的酵母双杂交cDNA文库。以中蔬6号番茄花柄为试材,选取其不同脱落阶段的离区,提取总RNA,利用SMART技术合成双链cDNA,产物经CHROMA SPINTM+TE-400柱纯化后,与载体pGADT7-Rec共转化入酵母菌Y187感受态中,在缺少亮氨酸的培养基(SD-Leu with agar)上培养收集所有克隆。经鉴定,cDNA文库的转化效率为5.6×10~6cfu·μg^(-1),文库容量为2.4×10~7cfu,文库滴度为4.9×10~8cfu·mL^(-1),平均插入片段长度大于1000bp,重组率为100%。随机挑取20个单克隆测序,比对NCBI数据库分析获得了19个已知蛋白序列和1个未知蛋白序列。已知功能的序列编码的蛋白分为4类,包括酶类蛋白、转录因子、载体蛋白和逆境响应蛋白,参与蛋白质磷酸化、水分运输和氧化还原反应等生物过程,其中7个序列之前被报道参与脱落。结果表明获得该文库质量较高,为筛选番茄花柄脱落过程中的互作蛋白奠定了基础。
