猪CD163 cDNA扩增及其稳定表达细胞系(CHO-K1)的建立 被引量：1

1

作者 徐建 霍珊珊 +4 位作者 张建楼 张永红 崔丹 仲飞 李秀锦 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期88-92,122,共6页

猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI... 猪CD163是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的重要受体之一。为探讨此受体在病毒感染过程中与PRRSV的相互作用,需要建立稳定表达猪全长CD163基因的细胞系。首先通过RT-PCR方法从猪肺泡巨噬细胞中扩增猪全长CD163cDNA,然后通过KpnI和XhoI将其插入到pcDNA3.1A质粒中,构建成真核表达载体。将表达载体转染CHO-K1细胞,通过G418加压,筛选出在细胞膜上稳定表达猪CD163的细胞系。结果显示,扩增出的猪CD163基因与基因库的序列基本一致,个别碱基的突变没有引起编码氨基酸的改变。通过转染表达载体和G418筛选,成功构建了稳定表达猪全长CD163基因的CHO-K1细胞系。经流式细胞仪检测证实,重组猪CD163可在CHO-K1细胞膜上进行表达,这为进一步研究PRRSV与CD163受体相互作用提供了必要条件。 展开更多

关键词 猪CD163 稳定表达细胞系 CHO-K1细胞 流式细胞术

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四氧嘧啶与链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病模型的效果比较 被引量：68

2

作者 杨润军 李青旺 赵蕊 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2006年第2期17-20,共4页

用相同总剂量的四氧嘧啶1次给药和2次给药及较大剂量链脲佐菌素1次给药3种方法诱导小白鼠糖尿病模型,多次测定血糖,体重等糖尿病相关指标,以确定糖尿病模型建立的最佳方法。结果表明,四氧嘧啶建模率为91．94％,高于链脲佐菌素建模率(66... 用相同总剂量的四氧嘧啶1次给药和2次给药及较大剂量链脲佐菌素1次给药3种方法诱导小白鼠糖尿病模型,多次测定血糖,体重等糖尿病相关指标,以确定糖尿病模型建立的最佳方法。结果表明,四氧嘧啶建模率为91．94％,高于链脲佐菌素建模率(66．7％)(P<0．05);四氧嘧啶建模组的死亡率为15％及体重下降率为 18．1％,均高于链脲佐菌素建模组(死亡率3．3％,体重下降率12．0％)(P<0．05);四氧嘧啶连续2次小剂量给药的建模效果优于1次性大剂量给药。两种药物比较,虽然四氧嘧啶的建模率高于链脲佐菌素,但其对建模小鼠的损害亦明显大于链脲佐菌素,建模时连续小剂量给药,并于4．5～5 h后灌胃质量分数50％葡萄糖,可以降低死亡率, 提高建模率。 展开更多

关键词 糖尿病 动物模型 四氧嘧啶 链脲佐菌素 葡萄糖

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鬼针草90%醇提物对U_(14)荷瘤小鼠的抑瘤效应 被引量：11

3

作者 冯涛 李青旺 +1 位作者 李健 刘智华 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2007年第4期1037-1038,共2页

以U14细胞株接种小鼠制成荷瘤模型,研究鬼针草90%醇提物对荷瘤小鼠的抑瘤效应。结果表明,90%鬼针草醇提物通过提高机体免疫力抑制小鼠肿瘤生长。

关键词 鬼针草 免疫器官 抑瘤作用 U14小鼠

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GFP mRNA在树突状细胞中的转染及其影响因素分析 被引量：6

4

作者 仲飞 仲振宇 +1 位作者 梁爽 李秀锦 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期716-719,共4页

目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)mRNA在树突状细胞(DC)中的转染及其影响因素。方法:选用gfp报告基因,在体外利用含T7RNA聚合酶的mMESSAGERNA转录试剂盒,合成含有帽子结构的GFPmRNA,通过酵母多聚A聚合酶加尾,制备结构完整的GFPmRNA。与此同时... 目的:探讨绿色荧光蛋白(GFP)mRNA在树突状细胞(DC)中的转染及其影响因素。方法:选用gfp报告基因,在体外利用含T7RNA聚合酶的mMESSAGERNA转录试剂盒,合成含有帽子结构的GFPmRNA,通过酵母多聚A聚合酶加尾,制备结构完整的GFPmRNA。与此同时,从人的外周血液中分离单核细胞,并在体外经GM-CSF和IL-4刺激分化为DC。通过转染试剂介导将合成的GFPmRNA转染到DC内并使其表达。采用流式细胞术检测其转染效率和表达水平。结果:体外合成GFPmRNA,经转染试剂介导,实现了gfp基因在DC中的表达。不同的转染试剂、mRNA用量和细胞密度对mRNA的转染效率有较大的影响。采用Transmes-sengerTransfectionKit转染试剂,1μgGFPmRNA在200μLX-VIVO-15无血清培养基中的转染密度为2.5×109/L的DC,可获得较好的转染效果(转染效率达27%以上)。结论:在适当的条件下,通过mRNA转染DC可获得较高的转染效率。 展开更多

关键词 树突状细胞 MRNA GFP 基因转染

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N,N-二甲基甲酰胺(DMF)对猪精液冷冻效果的影响 被引量：3

5

作者 张树山 李青旺 +3 位作者 胡建宏 江中良 刘宏 王立强 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第11期51-54,61,共5页

【目的】研究N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Di methylformamide,DMF)与甘油配制的混合保护剂对猪冷冻精子的保护效果。【方法】以DMF和甘油配制成混合冷冻保护剂对猪精液进行冷冻,试验共设对照组(30mL/L甘油)、A组(10mL/L DMF+20mL/L甘油)、B组... 【目的】研究N,N-二甲基甲酰胺(N,N-Di methylformamide,DMF)与甘油配制的混合保护剂对猪冷冻精子的保护效果。【方法】以DMF和甘油配制成混合冷冻保护剂对猪精液进行冷冻,试验共设对照组(30mL/L甘油)、A组(10mL/L DMF+20mL/L甘油)、B组(20mL/L DMF+10mL/L甘油)、C组(30mL/L DMF)和D组(50mL/L DMF)5个处理组,以活动精子百分率、精子活率、精子直线运动速率、精子顶体完整率以及精子质膜完整率为检测指标,对猪精子冷冻效果进行评价。【结果】20mL/L DMF+10mL/L甘油混合冷冻保护剂对猪精子有较好的冷冻保护作用,与其他处理组相比,除精子直线运动速率和质膜完整率与10mL/L DMF+20mL/L甘油组无显著差异外,其他各项指标均优于其他组及甘油对照组。30mL/L DMF对猪精子的毒性强于同浓度甘油,但20mL/LDMF+10mL/L甘油混合冷冻保护剂的毒性与甘油对照组无显著差异(P>0.05)。【结论】20mL/L DMF+10mL/L甘油混合冷冻保护剂比单一使用甘油或DMF能起到更好的冷冻保护作用。 展开更多

关键词 猪精液 冷冻保存 N N-二甲基甲酰胺 精子品质

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密码子优化提高PRRSV GP5/M双基因在真核细胞中的同步表达 被引量：3

6

作者 张永红 徐建 +5 位作者 张建楼 霍珊珊 王利月 林洪羽 李秀锦 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期92-97,115,共7页

为提高猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)GP5和M蛋白基因在动物细胞中同步表达水平,本试验依据动物偏爱的密码子对GP5和M蛋白基因分别进行了密码子优化,并利用本室构建的含内部核蛋白体进入位点(IRES)载体pcDNA-IRES,将密码子优化的和... 为提高猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)GP5和M蛋白基因在动物细胞中同步表达水平,本试验依据动物偏爱的密码子对GP5和M蛋白基因分别进行了密码子优化,并利用本室构建的含内部核蛋白体进入位点(IRES)载体pcDNA-IRES,将密码子优化的和野生型的GP5基因和M蛋白基因分别插入到IRES的上下游,分别构建成GP5与His-标签融合和M蛋白与Myc-标签融合的密码子优化的和野生型的GP5/M双基因表达载体pcDNA-OpGP5/His-IRES-OpM/MH和pcDNA-GP5/His-IRES-M/MH,将双基因表达载体转染HEK293T细胞使其表达,通过Western blot检测,比较GP5和M蛋白在真核细胞的表达水平。结果显示,密码子优化可明显提高GP5和M在HEK293T细胞中的表达水平,本试验为GP5和M蛋白功能的研究提供了有利条件。 展开更多

关键词 密码子优化 PRRSV GP5蛋白 M蛋白 表达水平

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丹参酮ⅡA抑制LPS诱导人单核细胞促炎性分子的表达 被引量：2

7

作者 王利月 温洁霞 +5 位作者 林洪羽 李文艳 张建楼 张永红 李秀锦 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期85-90,共6页

为探讨丹参酮ⅡA(Tanshinone IIA,Tan IIA)抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的影响,用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)体外刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)及人单核细胞系(THP-1),通过ELISA和RT-PCR方法分别检测细胞的促炎性细胞因子(... 为探讨丹参酮ⅡA(Tanshinone IIA,Tan IIA)抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)的影响,用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)体外刺激人外周血单个核细胞(PBMCs)及人单核细胞系(THP-1),通过ELISA和RT-PCR方法分别检测细胞的促炎性细胞因子(IL-1β、TNFα、IL-6)和粘附分子VCAM-1的表达;同时用丹参酮IIA预先处理上述2种细胞,分析丹参酮IIA对LPS诱导细胞因子及粘附分子表达的影响。结果表明,LPS可明显诱导PBMCs和THP-1细胞IL-1β前体、TNFα、IL-6和VCAM-1的表达,而丹参酮ⅡA可明显抑制LPS诱导上述细胞因子及粘附分子表达,表明丹参酮ⅡA能够明显的抑制单核/巨噬细胞介导的炎性应答反应,为探索丹参酮ⅡA抗AS的机制提供了重要的试验依据。 展开更多

关键词 丹参酮ⅡA 人单核细胞系 单核/巨噬细胞 促炎性细胞分子

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腺病毒载体介导gfp基因在树突细胞的转导及其影响因素的分析 被引量：2

8

作者 仲飞 仲振宇 +1 位作者 梁爽 李秀锦 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第11期991-996,共6页

目的研究腺病毒载体介导外源基因在人树突细胞转染的有效方法。方法绿色荧光蛋白(gfp)报告基因重组腺病毒的构建采用直接连接法。人树突细胞的制备通过分离人外周血单核细胞,然后在体外经过诱导过程再生。结果经腺病毒介导实现了gfp基... 目的研究腺病毒载体介导外源基因在人树突细胞转染的有效方法。方法绿色荧光蛋白(gfp)报告基因重组腺病毒的构建采用直接连接法。人树突细胞的制备通过分离人外周血单核细胞,然后在体外经过诱导过程再生。结果经腺病毒介导实现了gfp基因在树突细胞的转导和表达。病毒滴度对转导效率影响较大,只有使用高滴度(MOI>100)的重组腺病毒才能获得较高的转导效率(40%以上);脂质体和多聚赖氨酸可以明显提高转导效率(提高50%左右),转导效率最高可达65%左右。结论由腺病毒介导进行树突细胞的转基因需要较高的病毒滴度;脂质体和多聚赖氨酸可以提高基因的转导效率。 展开更多

关键词 树突细胞 基因转导 腺病毒载体

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磷与奶牛营养需要的研究进展 被引量：1

9

作者 李玉龙 赵红卫 《中国奶牛》 2009年第6期19-23,共5页

磷元素对动物生理功能的影响非常显著,尤其是对奶牛的影响,本文以奶牛为例,重点综述磷在牛机体的分布和功能、磷的代谢平衡、磷缺乏、磷的需求量、磷状态指标、磷补充方法及其效率等,以便为我国奶牛业的发展提供理论指导和技术性参考。

关键词 奶牛 磷 磷代谢平衡 磷缺乏

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PRRSV对猪树突细胞可溶性CD83释放影响的分析

10

作者 李秀锦 霍珊珊 +5 位作者 张永红 张建楼 徐建 林洪羽 王利月 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期86-91,共6页

为研究猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)感染是否促进猪树突细胞可溶性CD83(sCD83)的释放,在体外用PRRSV感染猪树突细胞,通过ELISA检测了树突细胞培养基sCD83的含量,结果显示PRRSV可明显提高猪树突细胞培养基sCD83的含量,表明PRRSV促... 为研究猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)感染是否促进猪树突细胞可溶性CD83(sCD83)的释放,在体外用PRRSV感染猪树突细胞,通过ELISA检测了树突细胞培养基sCD83的含量,结果显示PRRSV可明显提高猪树突细胞培养基sCD83的含量,表明PRRSV促进树突细胞sCD83的释放。为研究PRRSV对猪树突细胞CD83表达的影响,用RT-PCR和流式细胞术分别检测了细胞CD83mRNA的水平和细胞膜CD83的含量。结果显示PRRSV可提高猪树突细胞CD83 mRNA的水平,然而对细胞膜CD83的含量影响不大,说明PRRSV促进sCD83释放的作用高于刺激CD83表达的作用,致使膜结合的CD83保持较低的水平。PRRSV诱导树突细胞sCD83的释放为探讨PRRSV感染引起免疫抑制提供了重要的线索。 展开更多

关键词 可溶性CD83 PRRSV 免疫抑制

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天冬氨酸激酶(AK)编码基因的克隆及其序列分析

11

作者 李秀锦 仲飞 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期12-17,共6页

用PCR方法从谷氨酸棒杆菌突变株ZL9601基因组中扩增获得了天冬氨酸激酶(AK)编码基因,并对该基因编码区(1263bp)进行了序列分析。结果表明:本文扩增的AK基因编码与文献报道的序列基本一致,通过与不同作者克隆的AK基因序列进行比较,同源... 用PCR方法从谷氨酸棒杆菌突变株ZL9601基因组中扩增获得了天冬氨酸激酶(AK)编码基因,并对该基因编码区(1263bp)进行了序列分析。结果表明:本文扩增的AK基因编码与文献报道的序列基本一致,通过与不同作者克隆的AK基因序列进行比较,同源性最高达99 7%,最低达97 2%。这些碱基的差异均表现为碱基取代,多数碱基取代未引起编码氨基酸的改变,仅有少数碱基取代导致编码氨基酸的变化。由此可见,谷氨酸棒杆菌AK基因的碱基序列存在着多态性。 展开更多

关键词 AK基因 克隆 序列分析 谷氨酸棒杆菌

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人IgG Fc基因的扩增及其在真核细胞中的分泌性表达 被引量：1

12

作者 仲峰 李秀锦 +1 位作者 贾翠云 仲飞 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期496-499,共4页

目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础。方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用T... 目的:通过扩增人IgG Fc基因并与人CD5基因信号肽序列融合,构建真核分泌型表达载体,实现在真核细胞中高效表达,为利用Fc基因制备融合抗原,研究抗原基因和抗原蛋白的免疫治疗奠定了基础。方法:从外科手术切除的扁桃体中分离人淋巴细胞,用Trizol试剂提取淋巴细胞的总RNA,通过RT-PCR方法从淋巴细胞中扩增人IgG Fc片段的基因序列,并将其克隆到pMD-T18质粒载体上。然后以上述含有Fc片段序列的质粒载体和含有人CD5基因的质粒为模板,通过重叠延伸PCR方法将Fc片段与CD5信号肽基因序列进行融合,并将其插入到pcDNA3.1A真核表达载体上,构建成与CD5信号肽融合的Fc片段基因的分泌型表达载体。经磷酸钙介导转染293T细胞使其表达。结果:测序表明扩增的Fc基因序列与GeneBank发表的序列完全一致,Western blot检测结果表明,本实验构建的Fc基因分泌型表达载体能够在真核细胞进行高效分泌性表达,表达水平在转染后48小时可达50μg/1×106细胞。结论:采用RT-PCR扩增了人IgG Fc cDNA基因,经过与人CD5信号肽序列融合构建了分泌型表达载体,实现了在293T细胞中的高效表达,这为今后构建特定抗原基因与IgG Fc基因融合表达载体,研究DNA疫苗及Fc的生物佐剂提供了实验依据。 展开更多

关键词 IgG FC 293T细胞 分泌表达 CD5信号肽

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卵丘细胞对卵母细胞IVM及分子机制的研究进展

13

作者 侯伟媛 赵红卫 《黄牛杂志》 2005年第3期46-48,52,共4页

卵母细胞的成熟是当前胚胎工程及相关动物生物技术的基础及重要环节,对体外受精、转基因、胚胎克隆以及相关生物技术的发展具有重要的意义,本文主要将卵母细胞体外成熟的分子机制、卵丘细胞对卵母细胞成熟影响因素、目前取得成果以及存... 卵母细胞的成熟是当前胚胎工程及相关动物生物技术的基础及重要环节,对体外受精、转基因、胚胎克隆以及相关生物技术的发展具有重要的意义,本文主要将卵母细胞体外成熟的分子机制、卵丘细胞对卵母细胞成熟影响因素、目前取得成果以及存在的问题等方面进行归纳总结,为进一步的研究提供理论依据。 展开更多

关键词 分子机制 卵丘细胞 研究进展 IVM 动物生物技术 卵母细胞成熟 重要环节 胚胎工程 体外受精 胚胎克隆 体外成熟 归纳总结 转基因 相关

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