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猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用
被引量：
1
1
作者
刘博
张倩
+6 位作者
莫玲
林盼盼
谷英华
刘海隆
蔡青云
张艳
王文秀
《动物医学进展》
北大核心
2023年第9期19-23,共5页
根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物,构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验,成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma h...
根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物,构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验,成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝,熔解曲线有单一峰,批内变异系数CV为0.067%~0.184%,批间变异系数为0.221%~0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平,感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高,在感染后14 d可达到高峰,平均mRNA拷贝数达18000左右,可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。
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关键词
NLRP3基因
实时荧光定量PCR
猪肺炎支原体
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职称材料
犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备
被引量：
2
2
作者
薛姣雄
赵婷芳
+9 位作者
张倩
唐青海
高翠翠
赵铖
张妍
全飞杨
刘婷
杨灿
杨海
王文秀
《浙江农业学报》
CSCD
北大核心
2023年第11期2568-2583,共16页
为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构...
为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株;用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白;纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原,免疫蛋鸡,用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体,通过Western blot检测抗体滴度,用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示,S1蛋白全长无表达,CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应,胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上,本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白,制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。
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关键词
犬冠状病毒
原核表达
佐剂
卵黄抗体
小分子抗体Fab
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职称材料
题名
猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用
被引量：
1
1
作者
刘博
张倩
莫玲
林盼盼
谷英华
刘海隆
蔡青云
张艳
王文秀
机构
山东省
滨州
畜牧兽医
研究
院
山东省院士工作站
山东绿都生物
科技
有限公司
滨州市沾化区科技创新发展研究中心
滨州市
滨城区农业农村综合服务
中心
海南省农业科学院畜牧兽医
研究
所
出处
《动物医学进展》
北大核心
2023年第9期19-23,共5页
基金
山东省外专双百计划项目(WST2018014)
海南省家畜家禽工程技术研究中心开放课题(HLP201801)
+1 种基金
2021年海南省农业科学院重点实验室开放课题
中央引导地方科技发展专项资金(ZY2022HN09)。
文摘
根据NCBI NLRP3 cds(NM-001256770)序列设计1对特异性引物,构建标准品质粒pMD18T-NLRP3-189。通过反应条件优化、稳定性、敏感性等试验,成功建立了NLRP3的SYBR GreenⅠreal-time PCR检测方法,用该方法定量检测猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)感染后的猪肺组织中NLRP3表达水平。最佳引物浓度为0.15μmol/L,建立的标准曲线方程为y=-3.5196x+36.968,E值为0.96,最低检测量为84个拷贝,熔解曲线有单一峰,批内变异系数CV为0.067%~0.184%,批间变异系数为0.221%~0.594%,重复性好。该方法检测仔猪在感染Mhp后肺组织中的NLRP3 mRNA表达水平,感染组与健康组相比差异显著(P<0.01),NLRP3表达水平明显增高,在感染后14 d可达到高峰,平均mRNA拷贝数达18000左右,可持续42 d。表明该检测方法稳定性良好,精确度高,特异性强,为进一步研究猪炎症小体NLRP3的激活及其相关炎症反应机制提供了技术支持。
关键词
NLRP3基因
实时荧光定量PCR
猪肺炎支原体
Keywords
NLRP3 gene
real-time PCR
Mycoplasma hyopneumoniae
分类号
S858.28 [农业科学—临床兽医学]
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职称材料
题名
犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备
被引量：
2
2
作者
薛姣雄
赵婷芳
张倩
唐青海
高翠翠
赵铖
张妍
全飞杨
刘婷
杨灿
杨海
王文秀
机构
衡阳师范学院生命科学学院
滨州市沾化区科技创新发展研究中心
山东省
滨州
畜牧兽医
研究
院
出处
《浙江农业学报》
CSCD
北大核心
2023年第11期2568-2583,共16页
基金
国家级大学创新创业训练计划(校科字〔2021〕1-9/cxcy2022001)
2022年中央引导地方科技发展资金项目(2022ZYC091)
+1 种基金
湖南省自然科学基金面上项目(2021JJ30060)
湖南省教育厅科学研究项目重点项目(21A0442)。
文摘
为表达犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)S1蛋白,制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S 1基因全长及其截短片段,分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中,转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株;用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白;纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原,免疫蛋鸡,用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体,通过Western blot检测抗体滴度,用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示,S1蛋白全长无表达,CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈特异性反应,胃蛋白酶处理后制备的小分子抗体Fab可以有效阻断CCV的感染性。综上,本研究成功表达了CCV S1的2个截短片段蛋白,制备了卵黄抗体及其小分子抗体Fab,为进一步开展犬冠状病毒病的诊断和防治技术研究奠定了基础。
关键词
犬冠状病毒
原核表达
佐剂
卵黄抗体
小分子抗体Fab
Keywords
canine coronavirus
prokaryotic expression
adjuvant
egg yolk antibody
small molecule antibody Fab
分类号
S855.3 [农业科学—临床兽医学]
在线阅读
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
猪NLRP3基因Real-time PCR检测方法的建立及应用
刘博
张倩
莫玲
林盼盼
谷英华
刘海隆
蔡青云
张艳
王文秀
《动物医学进展》
北大核心
2023
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
犬冠状病毒S1蛋白特异性小分子抗体Fab的制备
薛姣雄
赵婷芳
张倩
唐青海
高翠翠
赵铖
张妍
全飞杨
刘婷
杨灿
杨海
王文秀
《浙江农业学报》
CSCD
北大核心
2023
2
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职称材料
已选择
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