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建立果蝇心脏发育候选基因CG3295的基因敲除系
1
作者 夏琼 邓云 +7 位作者 邓志伟 廖丹 戴悦 万永奇 莫小阳 李永清 王跃群 袁婺州 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2009年第3期74-77,共4页
果蝇CG3295基因是哺乳动物基因RMND5在果蝇中的同源物,其功能未知.利用P转座子敲除技术进行果蝇CG3295基因的敲除研究,将果蝇14234系的P转座子与Δ2-3系中的转座酶基因组合到同一个体,使P转座子在体内敲掉目的基因.从后代挑选不含P转座... 果蝇CG3295基因是哺乳动物基因RMND5在果蝇中的同源物,其功能未知.利用P转座子敲除技术进行果蝇CG3295基因的敲除研究,将果蝇14234系的P转座子与Δ2-3系中的转座酶基因组合到同一个体,使P转座子在体内敲掉目的基因.从后代挑选不含P转座子和转座酶基因的500头雄蝇分别与缺失了CG3295基因的测交系交配,从后代筛选获得20个CG3295基因敲除候选系.进一步利用Hand-GFP系使候选系的心脏表达绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下根据候选系是否表现心脏突变表型鉴定敲除系,最后获得了12个表现心脏突变表型的CG3295基因敲除系. 展开更多
关键词 果蝇 P转座子基因敲除 CG3295基因敲除系
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果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测 被引量：2
2
作者 雷旻音 杨哲 +3 位作者 黄婷 刘丹 李永青 吴秀山 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2012年第4期55-58,共4页
mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)... mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性. 展开更多
关键词 mrj基因 果蝇 多克隆抗体
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斑马鱼心脏标记基因pitx2的多克隆抗体的制备 被引量：2
3
作者 王华 张云 +1 位作者 吴秀山 袁婺洲 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2010年第2期98-101,共4页
pitx2基因是一类bicoid相关的同源异型框因子成员,介导心脏左右不对称发育和内脏器官的偏侧化.pitx2基因位于Nodal信号途径的下游,直接由Nodal信号分子控制.用PCR技术扩增斑马鱼pitx2基因的部分编码区,并将其插入到原核表达载体pGEX-4T-... pitx2基因是一类bicoid相关的同源异型框因子成员,介导心脏左右不对称发育和内脏器官的偏侧化.pitx2基因位于Nodal信号途径的下游,直接由Nodal信号分子控制.用PCR技术扩增斑马鱼pitx2基因的部分编码区,并将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒(pGEX-4T-1-pitx2)转入BL21感受态细胞,通过IPTG诱导表达融合蛋白,用GST珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体.获得了pitx2原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗pitx2多克隆抗体.提取斑马鱼不同器官和组织蛋白,用自制的多克隆抗体检测pitx2基因在斑马鱼中的表达情况,发现pitx2基因特异性地在心脏、脑、肌肉、小肠和肝脏表达,尤其在心脏中有很高的表达,表明制备的抗体特异性非常好. 展开更多
关键词 PITX2 融合蛋白 多克隆抗体
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CRISPR/Cas9系统对斑马鱼fhl1a基因敲除有效性的研究 被引量：1
4
作者 陈思行 陈发 +5 位作者 蔡湾湾 吴燕 廖艳伟 邓云 吴秀山 王跃群 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2017年第3期21-26,共6页
为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用,利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl1a基因的三号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体.将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中以期实现... 为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用,利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl1a基因的三号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体.将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中以期实现对目的靶基因fhl1a的敲除.随后收集部分72 h胚胎进行PCR检测和产物直接测序,确定有无突变.为进一步验证突变是否可稳定遗传,选择具有敲除了的F_0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F_1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析.结果显示F_1获得了不同程度的插入、缺失等突变类型.研究结果证明所设计的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系统能在斑马鱼体内有效地形成基因突变,该突变能稳定地遗传到下一代个体,这为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的具体调控机制打下了基础. 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 fhl1a基因 斑马鱼 敲除
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花旗松素对过氧化氢诱导H9C2细胞焦亡的保护作用 被引量：14
5
作者 叶艳琼 王晓莉 +4 位作者 蔡骞 庄建 谭小华 何微 赵明一 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第12期1367-1374,共8页
目的:探讨花旗松素(taxifolin)对大鼠心肌细胞株H9C2氧化损伤后焦亡的影响及其相关分子机制。方法:将体外培养的H9C2细胞分为对照组、H_2O_2处理组和taxifolin+H_2O_2处理组。倒置相差显微镜观察各组细胞形态;JC-1染色和流式细胞术检测... 目的:探讨花旗松素(taxifolin)对大鼠心肌细胞株H9C2氧化损伤后焦亡的影响及其相关分子机制。方法:将体外培养的H9C2细胞分为对照组、H_2O_2处理组和taxifolin+H_2O_2处理组。倒置相差显微镜观察各组细胞形态;JC-1染色和流式细胞术检测各组细胞线粒体膜电位;线粒体绿色荧光探针(mito-tracker green)法检测线粒体活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量的变化;Western印迹检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)蛋白表达水平;反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测细胞中白介素-18(interleukin-18,IL-18)、白介素-1a(interleukin-1a,IL-1a)、白介素-1b(interleukin-1b,IL-1b)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)、凋亡相关微粒样蛋白(apoptosis-associated apeck-like protein,ASC)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体样蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)和核苷酸结合寡聚化结构域受体家族半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶募集域蛋白质4(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family caspase recruitment domain-containing protein 4,NLRC4)的m RNA表达水平。结果:与对照组比较,H_2O_2处理组的细胞形态明显改变,taxifolin+H_2O_2处理组的细胞形态较H_2O_2处理组明显改善。与对照组比较,H_2O_2处理组的线粒体膜电位明显下降,线粒体ROS合成明显增多(均P<0.05);taxifolin+H_2O_2处理组的线粒体膜电位较H_2O_2处理组升高、线粒体ROS合成较H_2O_2处理组减少(均P<0.05)。同时,与对照组比较,H_2O_2处理组的细胞内caspase-1的蛋白表达以及IL-18,IL-1a,IL-1b,AIM2,ASC,NLRP3和NLRC4的m RNA表达显著上调(均P<0.05),taxifolin+H_2O_2处理组的caspase-1蛋白表达以及IL-18,IL-1a,IL-1b,AIM2,ASC,NLRP3和NLRC4的m RNA表达较H_2O_2处理组显著下调(均P<0.05)。结论:Taxifolin可能通过抑制经典焦亡途径中AIM2,NLRP3和NLRC4炎性小体的生成和激活,从而抑制H9C2细胞氧化损伤后的焦亡发生。 展开更多
关键词 花旗松素 细胞焦亡 氧化应激 炎性小体 心肌细胞
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斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析 被引量：6
6
作者 朱婷 黄文 +6 位作者 王跃群 李永青 袁婺洲 莫小阳 万永奇 吴秀山 邓云 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2010年第1期108-113,共6页
为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白,经GST... 为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western b lotting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627 bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;IPTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49 000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性. 展开更多
关键词 hand2 斑马鱼 原核表达 多克隆抗体
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斑马鱼HAS2基因的克隆、抗体制备及分析 被引量：2
7
作者 杨建华 杨青 +5 位作者 吴秀山 袁婺洲 王跃群 李永青 莫小阳 万永奇 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2010年第3期73-77,共5页
HAS2是斑马鱼心脏发育的一个标志基因,为了利用斑马鱼动物模型进一步研究HAS2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼HAS2基因的片段.将所得的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-HA... HAS2是斑马鱼心脏发育的一个标志基因,为了利用斑马鱼动物模型进一步研究HAS2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼HAS2基因的片段.将所得的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-HAS2)转化大肠杆菌(E.coli)BL21,IPTG诱导表达GST-HAS2融合蛋白;通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体活性.生物信息学分析结果表明:斑马鱼HAS2基因的开放阅读框含有1 658 bp,编码552个氨基酸;SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约为4.5×104;Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的特异性. 展开更多
关键词 HAS2 斑马鱼 原核表达 多克隆抗体
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Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备
8
作者 赵碧峰 唐雄卓 +5 位作者 李发祥 肖丽娜 杨荣 江志钢 吴秀山 王跃群 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2012年第2期67-70,共4页
Pericardin基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核... Pericardin基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogal-actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin多克隆抗体,为Pericardin功能的进一步研究奠定了基础. 展开更多
关键词 Pericardin 果蝇 原核表达 多克隆抗体
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果蝇Mef2基因多克隆抗体的制备及检测
9
作者 朱玲 徐腊梅 +2 位作者 盛立翔 吴秀山 莫小阳 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2012年第5期64-67,共4页
为了在果蝇模型中进一步研究Mef2基因的功能,制备了Mef2多克隆抗体.以果蝇cDNA文库为模板,PCR扩增出亲水性和特异性均好的果蝇Mef2基因片段,将其克隆入pET-28a原核表达载体,然后将重组质粒转化入大肠杆菌菌株Rossetea,用IPTG诱导表达融... 为了在果蝇模型中进一步研究Mef2基因的功能,制备了Mef2多克隆抗体.以果蝇cDNA文库为模板,PCR扩增出亲水性和特异性均好的果蝇Mef2基因片段,将其克隆入pET-28a原核表达载体,然后将重组质粒转化入大肠杆菌菌株Rossetea,用IPTG诱导表达融合蛋白.融合蛋白先经Ni-IDA凝胶柱纯化,再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,然后用不同浓度的抗体分别进行Western-blot实验检测抗体效价.所得结果显示获得了较高效价的果蝇Mef2多克隆抗体. 展开更多
关键词 Mef2 原核表达 多克隆抗体
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LRRC10基因促进肺癌细胞的凋亡
10
作者 沈忠原 刘文邦 +5 位作者 刘志强 何静怡 花瑞 范雄伟 吴秀山 张凯 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2018年第4期41-46,共6页
为证实心脏中存在一系列特异性表达基因,对细胞增殖发挥着禁锢作用,依据细胞的全能性,这些基因存在抑制癌细胞增殖的可能,将心脏特异性高表达基因LRRC10作为肺癌中的候选因子,首先利用COSMIC网站对LRRC10基因进行生物信息学、生物统计... 为证实心脏中存在一系列特异性表达基因,对细胞增殖发挥着禁锢作用,依据细胞的全能性,这些基因存在抑制癌细胞增殖的可能,将心脏特异性高表达基因LRRC10作为肺癌中的候选因子,首先利用COSMIC网站对LRRC10基因进行生物信息学、生物统计学分析,其次采用细胞流式分析LRRC10基因过表达A549后细胞的周期和凋亡情况.结果显示:LRRC10基因在多个肺癌病人中存有错义突变、拷贝数增加和表达上调的现象.A549细胞中过表达LRRC10基因后,基本不影响细胞周期,但表现出促进A549细胞凋亡的趋势.结果提示心脏特异性基因LRRC10的上调可能通过调节癌细胞凋亡参与肺癌的发生.这为心脏特异性基因在肺癌细胞凋亡中的作用提供了实验证据. 展开更多
关键词 LRRC10基因 生物信息学 细胞周期 细胞凋亡
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