目的:克隆表达鸡蛋主要过敏原Gal d 3基因并检验其免疫活性。方法:提取鸡蛋的总RNA,采用RT- PCR方法扩增出目的基因片段,将其克隆入T载体中进行测序和分析。设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT- PCR获得整个短的开放阅读框并将目的基...目的:克隆表达鸡蛋主要过敏原Gal d 3基因并检验其免疫活性。方法:提取鸡蛋的总RNA,采用RT- PCR方法扩增出目的基因片段,将其克隆入T载体中进行测序和分析。设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT- PCR获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中进行诱导表达。通过Ni^(2+)亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(Western blotting)方法检测其IgE结合活性。结果:克隆获得了鸡蛋主要过敏原Gal d 3。基因开放阅读框为2118个碱基(包括终止密码子),编码705个氨基酸。该序列编码的蛋白等电点为6.5,相对分子质量约为76000。表达产物经亲和层析纯化,用Western blotting方法检测免疫学活性,目的蛋白具有良好的免疫原性。结论:成功地克隆和表达了鸡蛋主要变应原Gal d 3基因,该蛋白具有良好的免疫原性。展开更多
粉尘螨是诱导过敏性疾病的重要变应原,可诱发Ⅰ型变态反应,对其免疫原性的鉴定是研究过敏性鼻炎等过敏性疾病的基础.首次对粉尘螨过敏原基因Der f 35进行克隆表达、纯化及免疫原性鉴定,提取粉尘螨总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),根...粉尘螨是诱导过敏性疾病的重要变应原,可诱发Ⅰ型变态反应,对其免疫原性的鉴定是研究过敏性鼻炎等过敏性疾病的基础.首次对粉尘螨过敏原基因Der f 35进行克隆表达、纯化及免疫原性鉴定,提取粉尘螨总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),根据已知基因序列(GenBank:LC175222.1)设计引物进行反转录聚合酶链式反应扩增,经Bam H I和Xho I双酶切,连接构建pET-32a-Der f 35载体,并克隆至大肠杆菌TOP 10菌株,取1 mL克隆菌液进行测序.使用试剂盒提取高纯度质粒转至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导、表达纯化及免疫学鉴定,并进行同源性比对分析、进化树构建及二级结构预测.克隆和表达结果显示,Der f 35基因的片段长约436个碱基对(base pair,bp);重组蛋白Der f 35相对分子质量约为30 ku(1 u=1 D),与预期结果相符.蛋白质印迹法结果证明,Der f 35与尘螨过敏性疾病患者的血清结合有明显的反应原性.生物信息学进化树结果显示,粉尘螨与屋尘螨、热带无爪螨、害嗜鳞螨、绵羊痒螨和免耳痒螨亲缘关系较近,二级结构预测显示Der f 35的氨基酸序列由2个α螺旋、6个β折叠、2个β转角和10个无规则卷曲片段组成.研究结果可为尘螨过敏性疾病的诊断与治疗提供理论依据.展开更多
文摘目的:克隆表达鸡蛋主要过敏原Gal d 3基因并检验其免疫活性。方法:提取鸡蛋的总RNA,采用RT- PCR方法扩增出目的基因片段,将其克隆入T载体中进行测序和分析。设计带有酶切位点的特异性引物,采用RT- PCR获得整个短的开放阅读框并将目的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中进行诱导表达。通过Ni^(2+)亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,采用免疫印迹(Western blotting)方法检测其IgE结合活性。结果:克隆获得了鸡蛋主要过敏原Gal d 3。基因开放阅读框为2118个碱基(包括终止密码子),编码705个氨基酸。该序列编码的蛋白等电点为6.5,相对分子质量约为76000。表达产物经亲和层析纯化,用Western blotting方法检测免疫学活性,目的蛋白具有良好的免疫原性。结论:成功地克隆和表达了鸡蛋主要变应原Gal d 3基因,该蛋白具有良好的免疫原性。
文摘粉尘螨是诱导过敏性疾病的重要变应原,可诱发Ⅰ型变态反应,对其免疫原性的鉴定是研究过敏性鼻炎等过敏性疾病的基础.首次对粉尘螨过敏原基因Der f 35进行克隆表达、纯化及免疫原性鉴定,提取粉尘螨总核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),根据已知基因序列(GenBank:LC175222.1)设计引物进行反转录聚合酶链式反应扩增,经Bam H I和Xho I双酶切,连接构建pET-32a-Der f 35载体,并克隆至大肠杆菌TOP 10菌株,取1 mL克隆菌液进行测序.使用试剂盒提取高纯度质粒转至感受态细胞Rosetta(DE3)中进行诱导、表达纯化及免疫学鉴定,并进行同源性比对分析、进化树构建及二级结构预测.克隆和表达结果显示,Der f 35基因的片段长约436个碱基对(base pair,bp);重组蛋白Der f 35相对分子质量约为30 ku(1 u=1 D),与预期结果相符.蛋白质印迹法结果证明,Der f 35与尘螨过敏性疾病患者的血清结合有明显的反应原性.生物信息学进化树结果显示,粉尘螨与屋尘螨、热带无爪螨、害嗜鳞螨、绵羊痒螨和免耳痒螨亲缘关系较近,二级结构预测显示Der f 35的氨基酸序列由2个α螺旋、6个β折叠、2个β转角和10个无规则卷曲片段组成.研究结果可为尘螨过敏性疾病的诊断与治疗提供理论依据.
