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猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析
被引量：
1
1
作者
张晶晶
孙慧敏
+1 位作者
宋家升
鲍恩东
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第3期515-521,共7页
[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sg...
[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化,以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性,通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带,表明重组病毒纯化成功,再通过PCR验证RFP基因有目的条带,表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示,与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F 1—F 10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象,表明重组病毒可稳定表达外源基因;测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线,重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株,为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。
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关键词
猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)
致弱毒株
重组病毒
病毒筛选
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职称材料
重组基因Ⅶ型新城疫病毒疫苗候选株的构建
2
作者
周洁
孙慧敏
+5 位作者
董嘉文
李林林
张俊勤
黄允真
汪招雄
孙敏华
《广东畜牧兽医科技》
2022年第6期10-14,共5页
新城疫是我国必须控制和净化的传染病之一,疫苗免疫是防控疾病的重要手段。为获得抗原性匹配的疫苗株,以新城疫LaSota疫苗株为骨架,替换当前流行的基因Ⅶ型毒株GM株的主要抗原性相关基因F(Fusion)和HN(Hemagglutinin-neuraminidase),拯...
新城疫是我国必须控制和净化的传染病之一,疫苗免疫是防控疾病的重要手段。为获得抗原性匹配的疫苗株,以新城疫LaSota疫苗株为骨架,替换当前流行的基因Ⅶ型毒株GM株的主要抗原性相关基因F(Fusion)和HN(Hemagglutinin-neuraminidase),拯救获得重组病毒rLa-mGM。生物学特性测定表明,重组毒株的MDT为160 h,ICPI为0,EID_(50)为10^(-8.4)/0.2 mL。将rLa-mGM株繁殖后以10^(8.0) EID_(50)制备灭活疫苗,与商品化LaSota疫苗各免疫10只25日龄SPF鸡,0.2 mL/只。免疫后14天,其血清平均HI效价为7.6log2,商品化LaSota疫苗免疫鸡的血清平均HI效价为7.4log2。结果表明重组病毒免疫原性良好,可作为疫苗候选株。
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关键词
新城疫
基因Ⅶ型
LaSota疫苗株
重组毒株
HI效价
疫苗候选株
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职称材料
表达绿色荧光蛋白的A型人源呼吸道合胞病毒反向遗传系统的构建
3
作者
倪思睿
简书令
+3 位作者
余飞
易若男
武小琰
鲍恩东
《南京农业大学学报》
2025年第6期1335-1342,共8页
[目的]为了更好地研究人呼吸道合胞病毒(HRSV)的发病机制并为其应用性研究提供便利,本研究构建了人源HRSV-A2毒株的反向遗传操作系统,并将绿色荧光蛋白(GFP)插入HRSV-A2基因组中,构建表达GFP的重组HRSV-A2。[方法]以细菌人工染色体(BAC...
[目的]为了更好地研究人呼吸道合胞病毒(HRSV)的发病机制并为其应用性研究提供便利,本研究构建了人源HRSV-A2毒株的反向遗传操作系统,并将绿色荧光蛋白(GFP)插入HRSV-A2基因组中,构建表达GFP的重组HRSV-A2。[方法]以细菌人工染色体(BAC)为载体骨架构建HRSV-A2毒株全长质粒,并以此为基础在P与M基因之间插入GFP基因;以pCI为载体构建分别表达HRSV N、P、M2-1和L蛋白的4个辅助质粒,并将5个质粒共转染于表达T7 RNA聚合酶的BHK21-T7细胞系进行病毒拯救。[结果]提取rBAC-RSV-A2重组病毒和表达绿色荧光的rBAC-RSV-A2-P-GFP-M重组报告病毒RNA,通过RT-PCR进行全基因组测序,结果表明重组病毒构建成功;在F_(1)—F_(9)连续传代过程中均有绿色荧光表达,F_(10)代荧光消失且无细胞病变;测定重组病毒的生长曲线结果表明,2株重组病毒的生长趋势与原始毒的生长趋势大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,重组病毒的噬斑小于亲本病毒,表明重组病毒增殖水平下降。[结论]本研究成功构建了以BAC载体为骨架的HRSV-A2感染性克隆,获得了可以表达GFP的重组HRSV病毒。该研究所建立的高效、稳定的HRSV反向遗传学系统,为HRSV致病机制研究、疫苗和抗体药物研发提供了有益的技术平台。
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关键词
人呼吸道合胞病毒
绿色荧光蛋白
反向遗传系统
重组病毒
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职称材料
题名
猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析
被引量：
1
1
作者
张晶晶
孙慧敏
宋家升
鲍恩东
机构
南京农业大学动物医学院
浙江迪福润丝生物科技有限公司
出处
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第3期515-521,共7页
基金
江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(22)2016]
南京农业大学校企合作项目(技术服务类)
文摘
[目的]为了开发一种能够预防感染、阻止潜伏期建立的猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)弱毒疫苗,利用同源重组以及CRISPR/Cas9技术将FHV-1的gIgE基因替换为红色荧光蛋白基因(RFP)。[方法]构建针对gIgE基因的3条sgRNA及表达Cas9蛋白的质粒,将含有sgRNA及Cas9蛋白的质粒与含有RFP的转移载体共转染到猫肾细胞(F81),通过噬斑纯化以及有限稀释方法进行病毒纯化,以重组病毒感染F81细胞连续10代验证其遗传稳定性,通过测定重组病毒以及亲本病毒H07的病毒滴度、一步生长曲线以及判断噬斑大小评价其生物学特性。[结果]成功构建了FHV-1 gIgE基因缺失毒株并将其命名为FHV-ΔgIgE-RFP;提取重组病毒DNA,通过PCR验证gIgE基因无目的条带,表明重组病毒纯化成功,再通过PCR验证RFP基因有目的条带,表明重组病毒成功插入外源基因。病毒滴度测定结果显示,与亲本病毒相比重组病毒的病毒滴度下降了90%;在F 1—F 10连续传代过程中RFP荧光表达且无减弱现象,表明重组病毒可稳定表达外源基因;测定FHV-ΔgIgE-RFP以及H07的生长曲线,重组病毒的生长趋势与亲本病毒大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,在病毒感染细胞前、后期,重组病毒的噬斑都小于亲本病毒,表明缺失gIgE基因后病毒毒力下降。[结论]成功构建并筛选出FHV-1 gIgE基因缺失致弱毒株,为开发疱疹病毒弱毒活载体疫苗奠定了基础。
关键词
猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)
致弱毒株
重组病毒
病毒筛选
Keywords
feline herpesvirusⅠ(FHV-1)
attenuated strain
recombinant virus
virus screening
分类号
S852.6 [农业科学—基础兽医学]
在线阅读
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职称材料
题名
重组基因Ⅶ型新城疫病毒疫苗候选株的构建
2
作者
周洁
孙慧敏
董嘉文
李林林
张俊勤
黄允真
汪招雄
孙敏华
机构
广东省农业科学院动物卫生研究所
长江大学动物科学学院
浙江迪福润丝生物科技有限公司
出处
《广东畜牧兽医科技》
2022年第6期10-14,共5页
基金
广州市科技计划项目(201904010379)
广东省自然科学基金项目(2018A0303130003)。
文摘
新城疫是我国必须控制和净化的传染病之一,疫苗免疫是防控疾病的重要手段。为获得抗原性匹配的疫苗株,以新城疫LaSota疫苗株为骨架,替换当前流行的基因Ⅶ型毒株GM株的主要抗原性相关基因F(Fusion)和HN(Hemagglutinin-neuraminidase),拯救获得重组病毒rLa-mGM。生物学特性测定表明,重组毒株的MDT为160 h,ICPI为0,EID_(50)为10^(-8.4)/0.2 mL。将rLa-mGM株繁殖后以10^(8.0) EID_(50)制备灭活疫苗,与商品化LaSota疫苗各免疫10只25日龄SPF鸡,0.2 mL/只。免疫后14天,其血清平均HI效价为7.6log2,商品化LaSota疫苗免疫鸡的血清平均HI效价为7.4log2。结果表明重组病毒免疫原性良好,可作为疫苗候选株。
关键词
新城疫
基因Ⅶ型
LaSota疫苗株
重组毒株
HI效价
疫苗候选株
Keywords
Newcastle disease
GenotypeⅦ
LaSota vaccine strain
Recombinant strain
HI titer
Vaccine candidate strain
分类号
S852.65 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
表达绿色荧光蛋白的A型人源呼吸道合胞病毒反向遗传系统的构建
3
作者
倪思睿
简书令
余飞
易若男
武小琰
鲍恩东
机构
南京农业大学动物医学院
出处
《南京农业大学学报》
2025年第6期1335-1342,共8页
基金
江苏省农业科技自主创新资金项目
南京农业大学校企合作项目(技术服务类)。
文摘
[目的]为了更好地研究人呼吸道合胞病毒(HRSV)的发病机制并为其应用性研究提供便利,本研究构建了人源HRSV-A2毒株的反向遗传操作系统,并将绿色荧光蛋白(GFP)插入HRSV-A2基因组中,构建表达GFP的重组HRSV-A2。[方法]以细菌人工染色体(BAC)为载体骨架构建HRSV-A2毒株全长质粒,并以此为基础在P与M基因之间插入GFP基因;以pCI为载体构建分别表达HRSV N、P、M2-1和L蛋白的4个辅助质粒,并将5个质粒共转染于表达T7 RNA聚合酶的BHK21-T7细胞系进行病毒拯救。[结果]提取rBAC-RSV-A2重组病毒和表达绿色荧光的rBAC-RSV-A2-P-GFP-M重组报告病毒RNA,通过RT-PCR进行全基因组测序,结果表明重组病毒构建成功;在F_(1)—F_(9)连续传代过程中均有绿色荧光表达,F_(10)代荧光消失且无细胞病变;测定重组病毒的生长曲线结果表明,2株重组病毒的生长趋势与原始毒的生长趋势大致相同,表明插入外源基因并不会改变病毒本身的生长特性;噬斑观察及染色结果显示,重组病毒的噬斑小于亲本病毒,表明重组病毒增殖水平下降。[结论]本研究成功构建了以BAC载体为骨架的HRSV-A2感染性克隆,获得了可以表达GFP的重组HRSV病毒。该研究所建立的高效、稳定的HRSV反向遗传学系统,为HRSV致病机制研究、疫苗和抗体药物研发提供了有益的技术平台。
关键词
人呼吸道合胞病毒
绿色荧光蛋白
反向遗传系统
重组病毒
Keywords
human respiratory syncytial virus
green fluorescent protein
reverse genetic system
recombinant virus
分类号
S852.6 [农业科学]
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题名
作者
出处
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被引量
操作
1
猫疱疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株的构建及生物学特性分析
张晶晶
孙慧敏
宋家升
鲍恩东
《南京农业大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
重组基因Ⅶ型新城疫病毒疫苗候选株的构建
周洁
孙慧敏
董嘉文
李林林
张俊勤
黄允真
汪招雄
孙敏华
《广东畜牧兽医科技》
2022
0
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职称材料
3
表达绿色荧光蛋白的A型人源呼吸道合胞病毒反向遗传系统的构建
倪思睿
简书令
余飞
易若男
武小琰
鲍恩东
《南京农业大学学报》
2025
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