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虾源干酪乳杆菌对罗氏沼虾生长、免疫与抗病力影响的研究
1
作者 黄雷 王子位 +6 位作者 袁雪梅 郑阿钦 陈静 彭先启 钱涛 原居林 姚嘉赟 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期402-411,共10页
干酪乳杆菌是广泛应用于水产养殖中的益生菌,但其对罗氏沼虾的作用尚不明确。本实验从罗氏沼虾肠道中分离到一株乳酸菌GCGR-16株,对分离株进行形态学观察、生化特性鉴定、16S rRNA基因的PCR扩增及序列分析,以鉴定该菌株的种属。采用牛... 干酪乳杆菌是广泛应用于水产养殖中的益生菌,但其对罗氏沼虾的作用尚不明确。本实验从罗氏沼虾肠道中分离到一株乳酸菌GCGR-16株,对分离株进行形态学观察、生化特性鉴定、16S rRNA基因的PCR扩增及序列分析,以鉴定该菌株的种属。采用牛津杯法和时间-杀菌曲线试验(Time-kill assay,TKA)测定分离菌对副溶血弧菌的抑制作用。结果显示,GCGR-16株为革兰氏阳性菌,与干酪乳杆菌的生化特征一致,且与干酪乳杆菌ATCC393株16S rRNA基因序列的同源性达100%。牛津杯法结果显示,分离菌培养液过滤组(上清液)、培养液组(pH4.0)、中性菌液组(pH7.0)的抑菌圈直径分别为15 mm、13 mm和11 mm;TKA结果显示,GCGR-16株培养液滤液组中副溶血弧菌的OD600nm值始终低于PBS对照组,表明该菌滤液含副溶血弧菌的抑菌活性成分。为探究干酪乳杆菌GCGR-16株对罗氏沼虾生长、免疫反应及抗病力的影响,在罗氏沼虾日粮中分别添加2 kg/t和4 kg/t的分离菌冻干粉,于实验第84 d测定各组罗氏沼虾的生长参数,于实验前及实验后第7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、84 d,通过体外吞噬活性试验测定各组虾不同时间点的血清对金黄色葡萄球菌的吞噬百分比(PP)和吞噬指数(PI),并采用试剂盒测定各组虾肝胰腺及血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)的含量。于分离菌饲喂实验结束后,采用1.5×10^(6)cfu/mL副溶血弧菌对各组虾攻毒。结果显示,4 kg/t和2 kg/t干酪乳杆菌添加组罗氏沼虾的体质量和亩产量均显著高于对照组(P<0.05),其中4 kg/t组罗氏沼虾的生长性能最佳,其体质量与亩产量分别较对照组提高25.4%和20.2%;4 kg/t组和2 kg/t组罗氏沼虾血清在各时间点的PP、PI,肝胰腺及血清中SOD、CAT、LZM、AKP的含量均显著高于对照组(P<0.05)。攻毒后7 d各组虾均不同程度死亡,死亡虾均出现肝胰腺发白、糜烂萎缩等剖检症状,存活虾活动能力明显减弱,未攻毒组虾均健活。4 kg/t组与2 kg/t组罗氏沼虾的存活率均显著高于对照组(P<0.05),两个剂量干酪乳杆菌对罗氏沼虾的保护率分别为33.3%与25.9%。综上所述,本研究首次证实罗氏沼虾体内分离的干酪乳杆菌GCGR-16株可有效提高罗氏沼虾的生长、免疫及抗病性能,为虾源益生菌的开发提供科学依据。 展开更多
关键词 罗氏沼虾 干酪乳杆菌 细菌鉴定 免疫作用 抗病力
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两种四氢异喹啉类药物体外抗大口黑鲈蛙虹彩病毒效果的研究
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作者 王慧 袁雪梅 +3 位作者 陈静 焦锦彪 葛海霞 姚嘉赟 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第5期465-472,共8页
为探究四氢异喹啉类药物β-咔啉-3-羧酸乙酯(β-CCE)和Boc-D-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Boc-DTic-OH)对大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)的体外抗病毒效果,本研究利用显微观察法测定细胞病变(CPE)效应、荧光定量PCR(qPCR)法检测病毒拷贝数以及... 为探究四氢异喹啉类药物β-咔啉-3-羧酸乙酯(β-CCE)和Boc-D-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸(Boc-DTic-OH)对大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)的体外抗病毒效果,本研究利用显微观察法测定细胞病变(CPE)效应、荧光定量PCR(qPCR)法检测病毒拷贝数以及CCK-8法测定细胞活力,从阻断、抑制及直接杀灭3个方面,分析β-CCE和Boc-D-Tic-OH的体外抗LMBV的活性。结果显示,β-CCE和Boc-D-Tic-OH对胖头鱼肌肉细胞(FHM)的安全浓度分别为10μg/mL和100μg/mL,阻断结果显示两种药物均可显著降低FHM的CPE,其阻断率均在95%以上,药物处理组病毒拷贝数极显著低于LMBV对照组(P<0.01);抑制结果显示,两种药物可一定程度降低FHM的CPE,10μg/mLβ-CCE处理组对病毒的抑制率为76.86%,β-CCE处理组以及100μg/mL、10μg/mL Boc-D-Tic-OH处理组病毒拷贝数均极显著低于LMBV对照组(P<0.01),β-CCE、Boc-D-Tic-OH发挥最好阻断效果的作用时间分别为2 h和1 h;药物作用6 h抑制效果最好;直接杀灭结果显示,0.1μg/mLβ-CCE能一定程度降低FHM的CPE,0.1μg/mLβ-CCE和10μg/mL Boc-D-Tic-OH对病毒的直接杀灭率最高,分别为90.93%和102.21%,且可极显著降低病毒拷贝数(P<0.01),两种发挥最佳直接杀灭作用的时间为2 h。上述结果表明,两种四氢异喹啉类药物均具有较好的体外抗LMBV效果,本研究为抗LMBV药物的研制提供参考。 展开更多
关键词 大口黑鲈 蛙虹彩病毒 四氢异喹啉类药物 抗病毒活性
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罗氏沼虾源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及致病性分析
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作者 赵梦瑶 陈静 +4 位作者 姚嘉赟 袁雪梅 黄雷 彭先启 张海琪 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期137-143,共7页
为探究患病罗氏沼虾的病原及其感染的防治措施,本研究从浙江省某养殖场采集10只患病罗氏沼虾的肝胰腺、鳃及肌肉样品分离获得一株优势菌。通过对该优势菌经革兰氏染色镜检及生化鉴定,结果表明分离菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freund... 为探究患病罗氏沼虾的病原及其感染的防治措施,本研究从浙江省某养殖场采集10只患病罗氏沼虾的肝胰腺、鳃及肌肉样品分离获得一株优势菌。通过对该优势菌经革兰氏染色镜检及生化鉴定,结果表明分离菌为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。采用PCR分别扩增分离菌的16S r RNA和gyr B基因序列,测序后经BLAST检索与这两种基因同源性均最高的菌株;通过MEGA 7.0软件中的Clustal W方法将分离菌与从Gen Bank中获得的同源性较高的菌株序列进行多序列比对,采用MEGA 7.0软件中的邻接法构建分离菌与上述菌株16S r RNA和gyr B基因的系统发育树。BLAST检索结果显示,分离菌与弗氏柠檬酸杆菌(KC210829.1)16S r RNA基因序列的同源性高达99.93%;与弗氏柠檬酸杆菌(KF156750.1)gyr B基因序列的同源性达98.76%。16S r RNA和gyr B基因的进化树结果显示,分离菌均与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支,且支持率高达99%。进一步表明引起罗氏沼虾发病的病原为弗氏柠檬酸杆菌。将分离菌分别以1.02×10^(9)cfu/m L~1.02×10^(4)cfu/m L 6种浓度感染健康罗氏沼虾,每日观察并记录罗氏沼虾的发病症状及死亡率,根据Probit回归法计算分离菌对罗氏沼虾的半数致死量(LD50)。结果显示,1.02×10^(6)cfu/m L以上浓度的弗氏柠檬酸杆菌均能够导致罗氏沼虾出现体型消瘦、行动迟缓无活力的症状,1.02×10^(5)cfu/m L以下浓度的弗氏柠檬酸杆菌并不致罗氏沼虾出现症状。经统计该菌株对罗氏沼虾的LD50为1.01×10^(7)cfu/m L,表明该菌株对罗氏沼虾的致病性较强。采用PCR分别检测该分离菌株的定居因子基因(cfa)、尿素酶基因簇(ure G、ure F、ure E、ure D)、Vi抗原基因(via B)、外膜蛋白基因(omp X)等7种毒力相关基因,结果显示该菌株分别扩增到375 bp(cfa)、119 bp(ure G)、300 bp(ure F)、247 bp(ure E)、243 bp(ure D)、875 bp(via B)及250 bp(oomp X)的7种毒力基因。采用K-B纸片扩散法测定分离菌对10类共35种药物的敏感性,结果显示该分离菌对β-内酰胺类的头孢他啶和头孢曲松、多肽素类的多黏菌素B、氨基糖苷类的庆大霉素以及拉氧头孢这5种药物敏感,对β-内酰胺类的青霉素、氯霉素类的氟苯尼考、多肽类的万古霉素及苯唑醂、克林霉素和新生霉素等27种药物呈不同程度的耐药性,且为多重耐药菌。综上所述,本研究从患病罗氏沼虾中分离到了一株弗氏柠檬酸杆菌,该菌携带多种毒力基因,对罗氏沼虾的致病性较强,为进一步研究弗氏柠檬酸杆菌对水产动物的致病性及对罗氏沼虾弗氏柠檬酸杆菌病的防治提供参考依据。 展开更多
关键词 罗氏沼虾 弗氏柠檬酸杆菌 致病性 毒力基因 药敏分析
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快速检测十足目虹彩病毒1 RPA-LFD方法的建立及初步应用 被引量：4
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作者 袁雪梅 陈静 +5 位作者 黄雷 蔺凌云 潘晓艺 彭先启 焦锦彪 姚嘉赟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期505-510,共6页
为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察... 为建立一种高效、快速、简便的十足目虹彩病毒1(DIV1)检测方法,本研究以DIV1 ATPase基因为检测靶标,设计特异性引物和探针,采用方阵法优化反应温度和时间,结果显示,重组酶聚合酶扩增技术(RPA)最优反应温度为37℃,时间为15 min,结果观察时间为5 min,检测过程总时长为20 min,初步建立了DIV1的重组酶聚合酶扩增技术结合侧向流试纸条方法(RPA-LFD)。提取其他7种常见虾类病原基因组与DIV1基因组,采用该方法检测,分析其特异性;构建重组质粒标准品p UC57-DIV1,10倍倍比稀释后采用该方法检测,分析其灵敏性;以3种不同浓度的重组质粒标准品为模板进行批间、批内重复性试验。结果显示,该方法能特异性检测DIV1,与虾类其他常见易感病原均无交叉反应;其对重组质粒标准品的检测限为1×10^(1)拷贝/μL;批内和批间重复性试验的检测结果均一致,重复性好。利用该方法与已发表的荧光定量PCR(qPCR)同时检测15份感染DIV1的罗氏沼虾样品及40份临床样品,结果显示,该方法的阳性检测率为69.09%(38/55),阴性率为30.91%(17/55),与q PCR检测结果一致,二者的阳性符合率、阴性符合率、总符合率均为100%。综上所述,本研究建立的RPA-LFD方法检测DIV1具有快速、简便、灵敏度高且特异性强的特点,且不需要精密昂贵的仪器设备,为基层实验室及现场检测提供了可行技术手段。 展开更多
关键词 重组酶聚合酶扩增 侧向流试纸条技术 十足目虹彩病毒I
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温度对罗氏沼虾感染虹彩病毒的影响及转录组学分析
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作者 赵梦瑶 陈静 +5 位作者 姚嘉赟 郑阿钦 袁雪梅 黄雷 彭先启 张海琪 《水生生物学报》 2025年第9期10-21,共12页
为探究温度对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)感染十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的影响及调控机制,研究设置5组不同温度(26、28、30、32、34℃)对罗氏沼虾人工感染DIV1,并统计其存活率,结果显示温度34℃能够... 为探究温度对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)感染十足目虹彩病毒1(Decapod iridescent virus 1,DIV1)的影响及调控机制,研究设置5组不同温度(26、28、30、32、34℃)对罗氏沼虾人工感染DIV1,并统计其存活率,结果显示温度34℃能够抑制罗氏沼虾体内的病毒复制,减少死亡并延长其存活时间。对感染DIV124h和72h的罗氏沼虾肝胰腺、鳃及肌肉进行病毒载量测定,结果表明感染DIV1的罗氏沼虾在72h内病毒迅速增殖,但当水温升高至30℃及更高温度时其体内的病毒载量明显降低。此外,采集罗氏沼虾不同温度下感染DIV1的肝胰腺进行转录组学分析,结果表明共有8483个不同差异表达基因,富集分析发现基因主要富集在花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)、糖酵解/糖异生(Glycolysis/Gluconeogenesis)、α-亚油酸代谢(alpha-Linolenic acid metabolism)等与Warburg效应相关的代谢通路中,推测这些基因和通路可能与病毒感染机制密切相关。对罗氏沼虾感染DIV1后的免疫基因CAT、Cu/ZnSOD、CTL、ACP的表达水平进行测定,结果发现当温度为32℃时免疫基因的表达量显著高于其他温度,表明高温能够促进罗氏沼虾的免疫基因表达量增加以抵御病毒入侵。研究通过分析不同温度对DIV1感染罗氏沼虾的影响,初步揭示了温度对病毒复制的影响及调控机制,为深入探究病毒感染的分子机制和开发抗病毒免疫技术奠定一定的基础。 展开更多
关键词 温度 十足目虹彩病毒1 转录组学分析 调控机制 罗氏沼虾
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