家蚕小热休克蛋白22.6基因的生物信息学分析及其原核表达 被引量：1

1

作者 王威 盛清 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2010年第4期625-629,共5页

小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白... 小热休克蛋白家族成员在结构上变化很大,是细胞或生物体被多种类型的胁迫所诱导新合成的或含量增加的一类蛋白质,目前研究相对较少。从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条序列,经过Blast比对和保守结构域分析后发现该蛋白属于家蚕小热休克蛋白,将其命名为BmHSP22.6;通过PCR扩增该基因的ORF序列,将其克隆到pET28a(+)表达载体的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间,获得重组质粒pET-28a-BmHSP22.6。该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得工程菌,用终浓度为1 mM的IPTG诱导目的基因表达。用镍柱分离上清裂解液,获得纯化的目的蛋白。 展开更多

关键词 家蚕 小热休克蛋白22.6 原核表达 纯化

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真核细胞蛋白质翻译起始研究进展 被引量：2

2

作者 周培 杨力 +3 位作者 陈佳 李伯良 赵学明 张耀洲 《浙江工程学院学报》 2004年第4期312-315,共4页

在大量有关机制的研究基础上,针对真核蛋白质翻译起始,提出了核糖体沿mRNA滑动识别翻译起始位点的机制和核糖体从mRNA内部识别翻译起始位点的机制。

关键词 蛋白质翻译 真核细胞 研究进展 核蛋白质 核糖体 RNA 机制 起始 研究基础

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水泡性口炎病毒与Monocyte及MoDC的互作研究

3

作者 邹胜利 聂作明 +2 位作者 吴祥甫 方心葵 孙涛 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2016年第5期749-753,共5页

为了探究水泡性口炎病毒（ Vesicular stomatitis virus, VSV）与天然宿主免疫细胞的互作关系,实验用M蛋白第51位甲硫氨酸残基缺失后的重组病毒（ VSVAM 51-GFP ）和第51位甲硫氨酸敲除、第 221位缬氨酸突变为 苯丙氨酸、第226位丝基酸... 为了探究水泡性口炎病毒（ Vesicular stomatitis virus, VSV）与天然宿主免疫细胞的互作关系,实验用M蛋白第51位甲硫氨酸残基缺失后的重组病毒（ VSVAM 51-GFP ）和第51位甲硫氨酸敲除、第 221位缬氨酸突变为 苯丙氨酸、第226位丝基酸突变为精氨酸的重组病毒（ VSV-MT-GFP ）以及野生型重组病毒（VSV-GFP）感染猪单核 细胞（ Monocyte）和单核细胞诱导的树突状细胞（ Monocyte-dcriveddendritic cell, MoDC）,通过空斑实验制作病毒生 长曲线,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞的感染状况, E LISA 检测细胞培养上清中的细胞因子表达变 化.结果表明, VSV、 VSVAM 51、 VSV-MT 均可感染 Monocyte和 MoDC,且 Monocyte的感染率仅为8.38%.3 种病 毒在 MoDC中可以大量复制,但无法在 Monocyte中扩增.且与野生型VSV相比, VSViM51、VSV-MT 细胞致病性 依次减弱.VSV能有效激活TNF -α、 IL-8、 FN-α 相关免疫细胞因子在MoDC中的表达,且 M 蛋白突变程度越大,病毒激活能力越强. 展开更多

关键词 水泡性口炎病毒 单核细胞 MoDC 互作 基质蛋白M

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家蚕表达人促红细胞生成素口服急性毒性和初步药效学研究

4

作者 李杰 谭淑敏 +4 位作者 王小飞 舒特俊 于威 张耀洲 陈剑清 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2014年第6期728-733,共6页

为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素(BmrhEPO)口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性,进行了小鼠口服BmrhEPO急性毒性实验,结果显示其对小鼠基本无毒或毒性极低,小鼠口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147 882IU/kg。肾性贫血小鼠以剂量为6... 为了研究家蚕表达的重组人促红细胞生成素(BmrhEPO)口服治疗肾性贫血的疗效并评价安全性,进行了小鼠口服BmrhEPO急性毒性实验,结果显示其对小鼠基本无毒或毒性极低,小鼠口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147 882IU/kg。肾性贫血小鼠以剂量为62 865IU/kg和20 955IU/kg的两个剂量组连续口服BmrhEPO一周,以小鼠血液网织红细胞数及百分率为药效指标,结果显示口服有药效,并且药效与剂量呈正相关。本实验为开发重组人促红细胞生成素口服药物提供了理论指导和实验基础。 展开更多

关键词 家蚕 EPO 口服 急性毒性 肾性贫血

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家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达

5

作者 陈晓平 于威 张耀洲 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2009年第5期747-753,763,共8页

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体(lowmolecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号:AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因... 从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体(lowmolecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号:AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5 kDa,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽。根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到pET-28a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,裂解菌作SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础。 展开更多

关键词 家蚕 低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体 30K蛋白 克隆 生物信息学分析

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家蚕孤雌生殖相关蛋白ERp57基因的克隆和分析 被引量：5

6

作者 于威 聂作明 +2 位作者 王丹 陈健 张耀洲 《丝绸》 CAS 北大核心 2007年第8期23-27,共5页

ERp57蛋白是一种二硫化物异构酶,它是目前发现的最为突出的多功能蛋白之一,除了二硫键的异构酶的基本功能外,还具有其他多种生物学功能。应用二维凝胶电泳(2DE)技术研究家蚕孤雌生殖的总蛋白质,通过和正常家蚕卵总蛋白进行比较分析得到... ERp57蛋白是一种二硫化物异构酶,它是目前发现的最为突出的多功能蛋白之一,除了二硫键的异构酶的基本功能外,还具有其他多种生物学功能。应用二维凝胶电泳(2DE)技术研究家蚕孤雌生殖的总蛋白质,通过和正常家蚕卵总蛋白进行比较分析得到家蚕卵中可能与孤雌生殖相关的差异蛋白点,得到了一个与家蚕蛋白折叠相关的钙结合蛋白——ERp57。根据已有的cDNA文库,从家蚕蛹中克隆得到的ERp57基因的cDNA。利用各种生物信息学的方法和工具,对这个基因的核酸水平和蛋白质水平进行了详细的分析,为进一步研究其结构与功能的关系提供参考。 展开更多

关键词 家蚕蛹 孤雌生殖 ERp57 TOF-TOF

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蛋白酶抑制剂的应用进展 被引量：2

7

作者 张苗 张耀洲 金勇丰 《农机化研究》 北大核心 2005年第2期202-204,共3页

蛋白酶抑制剂(PI)是在动植物及微生物体内广泛存在的一种对蛋白水解酶活性有抑制作用的小分子量蛋白质。蛋白酶抑制剂在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用,近年来发现它在许多疾病及病理过程中有控制作用。为此,综述了蛋... 蛋白酶抑制剂(PI)是在动植物及微生物体内广泛存在的一种对蛋白水解酶活性有抑制作用的小分子量蛋白质。蛋白酶抑制剂在调节蛋白酶活性和蛋白质代谢等方面起着重要的作用,近年来发现它在许多疾病及病理过程中有控制作用。为此,综述了蛋白酶抑制剂在农业和临床治疗上的应用。 展开更多

关键词 蛋白酶抑制剂 体内 临床治疗 病理过程 调节蛋白 应用进展 抑制作用 酶活性 控制作用 蛋白质

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马传染性贫血病毒膜蛋白基因的改造及其在真核细胞中的表达 被引量：1

8

作者 陈新江 孟庆来 +2 位作者 毛洁 张晓燕 张耀洲 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2008年第5期547-553,共7页

以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)天然膜蛋白基因(gp120)为基础设计的DNA疫苗在马体内的表达量很低,这与密码子使用偏嗜性、RNA剪切位点多和导致RNA不稳定性的腺苷丰富区的大量存在有关。为解决这些问题,合成了... 以马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)天然膜蛋白基因(gp120)为基础设计的DNA疫苗在马体内的表达量很低,这与密码子使用偏嗜性、RNA剪切位点多和导致RNA不稳定性的腺苷丰富区的大量存在有关。为解决这些问题,合成了EIAVgp120基因(Syn-env),使其密码子偏嗜性符合高水平表达的哺乳动物基因。EIAV弱毒疫苗的制备过程中,出现了几个重要而稳定的N-糖基突变位点,以Syn-env为基础,运用重叠延伸PCR定点突变策略获得了6个具有不同N-糖基缺失组合的gp120基因。将突变后的基因克隆到真核表达载体pVRCSV1.0,然后转染Hela细胞,发现这些重组质粒均获得了表达。进而为比较6种质粒诱导机体免疫保护效果,阐明EIAV弱毒疫苗减毒机理奠定了基础。 展开更多

关键词 马传染性贫血病毒 GP120 定点突变 N-糖基化位点 真核表达

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家蚕杆状病毒(BmNPV)Bm122基因的缺失影响芽生型病毒粒子的形成

9

作者 朱丽萍 于威 +2 位作者 陈滨 何欢 解纯刚 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2016年第2期277-282,共6页

为研究家蚕杆状病毒（BmNPV）编码的Bm122基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建了Bm122-ko-bacmid和Bm122-re-bacmid,实现对Bm122基因的敲除和异位补回。进而将Bm122-kobacmid、Bm122-re-bacmid、wtbacmid（野生... 为研究家蚕杆状病毒（BmNPV）编码的Bm122基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统分别构建了Bm122-ko-bacmid和Bm122-re-bacmid,实现对Bm122基因的敲除和异位补回。进而将Bm122-kobacmid、Bm122-re-bacmid、wtbacmid（野生型）分别转染BmN细胞,病毒滴度测定结果显示：Bm122缺失后,病毒无法形成正常水平的芽生型病毒粒子（budded virus,BV）,表明该基因是病毒生成有感染力的BV所必需的基因;透射电子显微镜观察发现,Bm122敲除后细胞内未观察到杆状病毒粒子,进一步证实Bm122的缺失影响了BV的生成。qPCR结果显示,Bm122缺失后病毒DNA复制水平降低。结果表明,Bm122是病毒生成正常水平的BV所必需的基因。 展开更多

关键词 家蚕杆状病毒 Bm122基因 Red重组技术 BAC-TO-BAC系统 病毒复制

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家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm56缺失对病毒复制和转录的影响 被引量：1

10

作者 石扬辉 朱丽萍 +3 位作者 张臣 袁佳 解纯刚 于威 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2014年第6期734-739,共6页

研究Bm56的生物学功能,利用Red重组系统构建了Bm56基因缺失型病毒vBm56-KO-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了Bm56基因补回型病毒vBm56-Re-Bacmid。然后将构建好的上述病毒转染BmN细胞,qPCR研究发现,Bm56敲除型病毒与野生病毒相比,在... 研究Bm56的生物学功能,利用Red重组系统构建了Bm56基因缺失型病毒vBm56-KO-Bacmid,并利用Bac-to-Bac系统构建了Bm56基因补回型病毒vBm56-Re-Bacmid。然后将构建好的上述病毒转染BmN细胞,qPCR研究发现,Bm56敲除型病毒与野生病毒相比,在囊膜病毒(Budded virus,BV)的产量上并没有统计学差异,表明Bm56基因不是病毒形成有感染活力病毒粒子的必需基因。同时qRT-PCR研究结果也显示,Bm56缺失没有明显降低病毒基因组的复制水平,进一步研究Bm56缺失对BmNPV基因转录的影响。qRT-PCR结果显示,Bm56对早晚期和极晚期基因的转录水平均没有明显的影响。说明Bm56不是BmNPV病毒复制的必需基因,对病毒早期基因、晚期基因和极晚期基因的转录水平均无显著影响,推测Bm56可能作为一种病毒结构蛋白,在病毒装配等环节中起着重要作用。 展开更多

关键词 BMNPV Bm56 RED重组 病毒复制 病毒转录

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家蚕新基因Bmbzj的表达、抗体制备及亚细胞定位

11

作者 高珍 卜远虹 +4 位作者 金邦泽 于威 刘悦 陈健 张耀洲 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2012年第3期414-417,共4页

在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426。该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj。Bmbzj基因全长661bp,由99bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)、486bp的开放读码框(ORF)和76bp的... 在自建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条新基因序列,GenBank登录号为DY231426。该基因是一个同源性很低的基因,未发现保守结构域,将其命名为Bmbzj。Bmbzj基因全长661bp,由99bp的5′端非翻译区序列(5′UTR)、486bp的开放读码框(ORF)和76bp的3′端非翻译区序列(3′UTR)组成。生物信息学分析结果表明蛋白Bmbzj可能存在跨膜区和信号肽。将该基因插入到载体pGEX-4T-3中,构建了该基因编码的重组质粒pGEX-4T-3-Bmbzj,转化大肠杆菌Rosetta后,IPTG诱导表达了该融合蛋白,并利用亲和层析的方法纯化该重组蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体。亚细胞定位实验结果表明该蛋白只存在于细胞质中。 展开更多

关键词 家蚕 Bmbzj基因 原核表达 纯化 亚细胞定位

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Bmp24缺失对家蚕核型多角体病毒基因组的复制、转录及病毒组装的影响

12

作者 陈琛 于威 +3 位作者 史利利 巩成见 蒋磊 童富淡 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2016年第1期109-115,共7页

研究Bmp24基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统构建Bmp24缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)和Bmp24修复型病毒(Bmp24-re-Bacmid)。然后将Bmp24-ko-Bacmid、Bmp24-re-Bacmid以及野生型病毒(wtBacmid)分别转染BmN细胞,病毒滴度... 研究Bmp24基因的生物学功能,利用Red重组技术和Bac-to-Bac系统构建Bmp24缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)和Bmp24修复型病毒(Bmp24-re-Bacmid)。然后将Bmp24-ko-Bacmid、Bmp24-re-Bacmid以及野生型病毒(wtBacmid)分别转染BmN细胞,病毒滴度测定发现3种病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞发病,但Bmp24-ko-Bacmid在各个时相的滴度值显著低于其他两种病毒(P<0.05)。电镜观察结果发现Bmp24-ko-Bacmid感染的细胞中只有少量细长的杆状结构,而其他两种病毒感染细胞后能够产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qPCR实验结果显示,Bmp24缺失不会影响病毒基因组的复制,同时qRT-PCR结果显示Bmp24缺失使早期、晚期基因和极晚期基因的转录水平显著低于野生型病毒(P<0.05)。 展开更多

关键词 家蚕核型多角体病毒 Bmp24基因 RED重组系统 BAC-TO-BAC系统

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基于RD-BmBacmid载体构建表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法

13

作者 梅文枫 钱月忠 +1 位作者 史翠萍 陈健 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2014年第6期672-677,共6页

研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家... 研究构建一种快速表达GFP蛋白的重组杆状病毒的方法。在复制缺陷型的家蚕杆状病毒(BmNPV)穿梭载体RD-BmBacmid基础上,利用PCR方法合成两端分别含有50bp左右同源臂的绿色荧光蛋白基因(AcGFP)片段和线性化的RD-BmBacmid共转染BmN细胞或家蚕幼虫,可以一步获得重组病毒,表达绿色荧光蛋白。实验结果表明,含有AcGFP基因的重组杆状病毒构建成功,在BmN细胞和家蚕幼虫中分别表达了绿色荧光蛋白。因而,本研究成功建立了一种快速构建重组杆状病毒并能够表达GFP蛋白的新方法。 展开更多

关键词 杆状病毒 RD-BmBacmid PCR 共转染 绿色荧光蛋白

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家蚕一个DDRGK超家族成员的克隆及分析

14

作者 宗志鹏 步翠玉 张耀洲 《浙江理工大学学报（自然科学版）》 2010年第4期620-624,640,共6页

DDRGK类蛋白是在动物及植物中发现的约有300个氨基酸残基的蛋白家族,含有一个高度保守的DDRGK基序,但功能还未知。在对家蚕幼虫cDNA文库的测序中发现了含有该保守结构域的EST序列,经过电子克隆、RT-PCR,获得该基因完整的cDNA序列,将其命... DDRGK类蛋白是在动物及植物中发现的约有300个氨基酸残基的蛋白家族,含有一个高度保守的DDRGK基序,但功能还未知。在对家蚕幼虫cDNA文库的测序中发现了含有该保守结构域的EST序列,经过电子克隆、RT-PCR,获得该基因完整的cDNA序列,将其命名BmDDRGK(GenBank登录号FJ645927)。然后构建了重组质粒转化到大肠杆菌BL21和Rosetta中诱导表达,但经SDS-PAGE检测未检测到重组蛋白的表达。利用Real-timePCR技术对BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期不同组织的mRNA表达水平进行了鉴定。绝对定量结果显示BmDDRGK在家蚕五龄幼虫期和蛹期的各个组织中均有较为明显的表达,在五龄幼虫期,以中肠、马氏管、睾丸表达量较高,在蛹期,以翅原基、睾丸的表达量较高。 展开更多

关键词 家蚕 BmDDRGK基因 克隆 序列分析 实时定量PCR

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