海洋生物黏附蛋白研究进展 被引量：10

1

作者 廖智 申望 王日昕 《浙江海洋学院学报（自然科学版）》 CAS 2007年第4期439-447,共9页

海洋附着生物粘合蛋白的研究对于生物粘合剂的开发及海洋防污行业均具有重要的意义。综述了对贻贝足丝蛋白,藤壶胶蛋白以及管栖毛虫管胶蛋白的研究进展。3种不同生物的黏附蛋白具有某些相似性,同时又各有其结构特点,对其蛋白质结构,功... 海洋附着生物粘合蛋白的研究对于生物粘合剂的开发及海洋防污行业均具有重要的意义。综述了对贻贝足丝蛋白,藤壶胶蛋白以及管栖毛虫管胶蛋白的研究进展。3种不同生物的黏附蛋白具有某些相似性,同时又各有其结构特点,对其蛋白质结构,功能及粘合机制的研究既具有重要的学术意义也具有广阔的应用前景。 展开更多

关键词 黏附蛋白 贻贝 足丝蛋白 藤壶胶 管胶

在线阅读 下载PDF 职称材料

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)血细胞cDNA文库的构建及部分EST序列分析 被引量：10

2

作者 王日昕 廖智 +3 位作者 刘梅 鲁涛 武梅 何光源 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期603-607,共5页

采用TRIZOLReagent提取厚壳贻贝血细胞总RNA,分离纯化mRNA,在此基础上以pCMV sport6质粒为载体通过Gateway技术构建了高质量的厚壳贻贝血细胞cDNA文库,以期获得厚壳贻贝血细胞的EST序列标签以及可能的免疫相关功能基因序列。从文库中随... 采用TRIZOLReagent提取厚壳贻贝血细胞总RNA,分离纯化mRNA,在此基础上以pCMV sport6质粒为载体通过Gateway技术构建了高质量的厚壳贻贝血细胞cDNA文库,以期获得厚壳贻贝血细胞的EST序列标签以及可能的免疫相关功能基因序列。从文库中随机挑选28个克隆进行序列测定及在线BLAST分析。结果表明,在28个随机克隆中,有4个克隆为rRNA基因,7个克隆为未知基因,推测是新基因,17个克隆为功能基因,包括脱氢酶,细胞色素氧化酶,热休克蛋白,金属结合蛋白,肌动蛋白等。以上研究结果为筛选厚壳贻贝免疫相关的新基因,深入研究厚壳贻贝免疫相关因子的分子多样性及免疫机制奠定了基础。 展开更多

关键词 厚壳贻贝 血细胞 免疫因子 CDNA文库 EST

在线阅读 下载PDF 职称材料

一种新型贻贝抗菌肽的分离纯化及鉴定 被引量：12

3

作者 孙敬敬 刘慧慧 +4 位作者 周世权 王信超 范美华 申望 廖智 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期563-570,共8页

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261... 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)广泛分布于我国东部海域,其体内富含各种抗菌肽分子,是研究软体动物免疫防御机制以及开发抗菌肽来源的新型生物抗生素的重要对象。采用多步反相高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,获得一种分子量为6261.55 D的具有抗菌活性的多肽成分;经多肽N端测序和基因克隆,结果表明该抗菌肽由55个氨基酸残基构成,含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。结构域分析表明该抗菌肽具有几丁质结合结构域(Chitin-biding domain),因此将该抗菌肽命名为mytichitin-A。Mytichitin-A对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,同时对真菌及革兰氏阴性菌也具有抑制作用。荧光定量PCR检测表明,mytichitin-A主要在厚壳贻贝的性腺组织中表达且在细菌诱导后12h其表达量达到峰值。研究为深入了解厚壳贻贝抗菌肽的分子多样性及免疫机制奠定了基础。 展开更多

关键词 厚壳贻贝 抗菌肽 几丁质结合结构域 荧光定量PCR

在线阅读 下载PDF 职称材料

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Ⅰ型Crustin抗菌肽的基因克隆与真核重组表达 被引量：6

4

作者 申望 叶茂 +1 位作者 石戈 王日昕 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期371-377,共7页

Crustin是目前报道广泛存在于甲壳类中的一类具有广谱抗菌活性的抗菌肽,主要由甲壳类血淋巴细胞合成。本研究采用RACE技术和真核表达技术,进行了三疣梭子蟹Crustin基因的克隆和重组表达研究。结果表明,在三疣梭子蟹血细胞Crustin基因cDN... Crustin是目前报道广泛存在于甲壳类中的一类具有广谱抗菌活性的抗菌肽,主要由甲壳类血淋巴细胞合成。本研究采用RACE技术和真核表达技术,进行了三疣梭子蟹Crustin基因的克隆和重组表达研究。结果表明,在三疣梭子蟹血细胞Crustin基因cDNA全序列中,开放阅读框编码110个氨基酸残基的Crustin前体,Crustin前体由N端21个氨基酸残基的信号肽、富含Cys结构域和C端WAP结构域三部分组成,属于I型Crustin,构建的分泌型真核表达质粒pVT102U/α-crustin转化酿酒酵母S78,经RT-PCR和SDS-PAGE电泳验证,表明重组Crustin表达成功。 展开更多

关键词 三疣梭子蟹 抗菌肽 I型Crustin CDNA克隆 真核表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3重组表达及黏附功能分析 被引量：6

5

作者 李楠楠 谭亮 +2 位作者 王智平 王信超 廖智 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期851-857,共7页

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3(mussel footprotein-3,mfp-3)是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3... 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)中富含各种黏附蛋白分子,其中贻贝足丝蛋白3(mussel footprotein-3,mfp-3)是贻贝用以与外界基质进行黏附的主要蛋白分子.贻贝足丝中天然的mfp-3的含量低,水溶性差,因此纯化困难.本文以厚壳贻贝足丝蛋白mfp-3的cDNA序列为目的基因,用PCR法扩增Mfp-3基因,并成功构建含有多聚组氨酸标签的重组mfp-3原核表达载体pET-21a/Mfp-3.经IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)诱导表达出重组蛋白,利用亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化,获得分子量为9.18 kD的重组蛋白.经酪氨酸酶催化、玻璃包被和石英晶体微天平(quartzcrystal microbalance,QCM)分析.结果表明,重组厚壳贻贝mfp-3蛋白经酪氨酸酶催化后,L-3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴,L-3,4-dihydroxyphenylalanine,DOPA)含量较高并且具有较好的黏附性能.上述研究为开发以mfp-3黏附蛋白为来源的生物粘合剂奠定了良好的基础. 展开更多

关键词 厚壳贻贝 足丝黏附蛋白 多巴 原核表达 石英晶体微天平

在线阅读 下载PDF 职称材料

三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库构建及EST初步分析 被引量：5

6

作者 申望 叶茂 +1 位作者 石戈 王日昕 《海洋渔业》 CSCD 北大核心 2010年第1期24-29,共6页

三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,奠定三疣梭子蟹病害防治理论基础,采用SMART技... 三疣梭子蟹是我国沿海重要养殖品种之一,近年来养殖病害呈逐年上升趋势,制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。为大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因,研究其免疫基因的功能和免疫机制,奠定三疣梭子蟹病害防治理论基础,采用SMART技术构建了三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库。经测定,文库滴度为1.14×107pfu/mL,文库总容量为5.7×107pfu,重组率达到98%,插入片段平均长度为817.5 bp。文库随机测序获得的70个全长cDNA,从中发现18个已知基因和5个未知基因。已知基因主要为多肽/蛋白质合成相关基因,共9个;免疫相关基因4个,分别是抗菌肽hyastatin、C-reactive prote in-1、profilin和m asquerade-like prote in,且4个免疫相关基因共有48个克隆,占测序总克隆的68.6%,表明血细胞中免疫相关基因表达非常活跃。研究结果证实,构建血细胞全长cDNA文库是大规模克隆三疣梭子蟹免疫相关基因的可靠途径,并为深入研究免疫相关基因的功能和免疫机制奠定基础。 展开更多

关键词 三疣梭子蟹 血细胞 全长CDNA文库 免疫相关基因 表达序列标签

在线阅读 下载PDF 职称材料

厚壳贻贝Mytilus coruscus足丝盘及足丝的多巴分析(英文) 被引量：4

7

作者 李楠楠 石戈 +2 位作者 杨宵旭 王智平 廖智 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期148-153,共6页

多巴(3,4-l-dihydroxyphenylalanine,DOPA)是贻贝足丝粘附蛋白中的一种特殊的氨基酸,由酪氨酸经羟化后生成,与贻贝足丝粘附蛋白的强粘附性能具有直接联系.目前,已鉴定的多种贻贝足丝蛋白序列中均发现有不同含量的DOPA存在.蛋白中DOPA的... 多巴(3,4-l-dihydroxyphenylalanine,DOPA)是贻贝足丝粘附蛋白中的一种特殊的氨基酸,由酪氨酸经羟化后生成,与贻贝足丝粘附蛋白的强粘附性能具有直接联系.目前,已鉴定的多种贻贝足丝蛋白序列中均发现有不同含量的DOPA存在.蛋白中DOPA的定量检测对于了解DOPA在蛋白粘附中的作用以及粘附蛋白的粘附机理具有重要意义.为了解厚壳贻贝足丝盘和足丝纤维中DOPA的含量以及DOPA与厚壳贻贝足丝蛋白的粘附性能之间的关系,利用氮蓝四唑(nitrobluetetrazolium,NBT)对DOPA的特异染色原理,结合蛋白质电泳、组织化学染色以及玻璃包被实验,分析和比较了厚壳贻贝足丝不同部位的DOPA含量、蛋白组成特点以及粘附能力.NBT可以在不水解蛋白质的情况下进行DOPA的定量分析,且与DOPA的氧化状态无关.研究结果表明,厚壳贻贝足丝盘中蛋白的DOPA含量明显高于足丝,两者DOPA含量相差2.33倍;蛋白质电泳结果表明,厚壳贻贝足丝盘和足丝纤维的蛋白质组成差异较大,足丝盘中的蛋白质分子量范围明显低于足丝纤维;玻璃包被实验结合POQuest软件半定量分析表明,厚壳贻贝足丝盘蛋白的粘附能力明显高于足丝纤维,且蛋白在玻璃表面的吸附能力与DOPA含量具有相关性.通过以上研究,建立了一种蛋白中DOPA的定量分析方法并初步了解了厚壳贻贝足丝盘和足丝纤维的蛋白组成、DOPA含量以及粘附性能之间的关系,为深入了解贻贝足丝的粘附性能、粘附机制以及开发新型生物粘合剂奠定了基础. 展开更多

关键词 MYTILUS coruscus 多巴(DOPA) 足丝 足丝纤维 足丝盘

在线阅读 下载PDF 职称材料

厚壳贻贝足丝盘黏附蛋白mcofp-3的重组真核表达 被引量：3

8

作者 李楠楠 王智平 +1 位作者 鲁涛 廖智 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期148-153,共6页

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)黏附蛋白分子mcofp-3(M.coruscusfoot protein-3)主要分布于贻贝足丝盘,贻贝在水环境下的黏附过程中起到关键作用,但因其难溶于水且在贻贝足丝盘中含量极低,故妨碍了对其进行深入研究。为建立厚壳贻贝足丝蛋... 厚壳贻贝(Mytilus coruscus)黏附蛋白分子mcofp-3(M.coruscusfoot protein-3)主要分布于贻贝足丝盘,贻贝在水环境下的黏附过程中起到关键作用,但因其难溶于水且在贻贝足丝盘中含量极低,故妨碍了对其进行深入研究。为建立厚壳贻贝足丝蛋白mcofp-3的真核表达体系,并获得足够的mcofp-3黏附蛋白进行后续研究,采用酵母表达体系对mcofp-3进行了重组表达。通过PCR方法克隆厚壳贻贝的mcofp-3基因,构建mcofp-3的酵母真核表达载体pVT102U/α/mcofp-3,鉴定结果表明,重组表达质粒pVT102U/α/mcofp-3由真核载体pVT102U/α和mcofp-3的成熟肽DNA片段组成,插入的mcofp-3成熟肽DNA片段与预期序列完全一致;采用LiAC转化法将重组表达质粒转化到S78酿酒酵母中,经过RT-PCR分析以及1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明,重组的mcofp-3得到了成功的转录;发酵菌液经阳离子交换柱及高效液相色谱分离,以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测,结果表明,重组的厚壳贻贝黏附蛋白分子mcofp-3得到了成功表达,表达产物分子量约为6kD,与预期分子量一致。 展开更多

关键词 厚壳贻贝 足丝蛋白mcofp-3 PCR 真核表达载体 酿酒酵母S78

在线阅读 下载PDF 职称材料

日本蟳(Charybdis japonica)微卫星位点的分离及遗传多样性分析 被引量：2

9

作者 叶茂 申望 +2 位作者 王日昕 郑兆祥 石戈 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期86-93,共8页

采用磁珠富集法,以生物素标记的(CA)12寡核苷酸为探针,构建了日本蟳基因组微卫星富集文库。通过PCR法从文库中共筛选出89个微卫星位点,其中完全型(perfect)共75个,占84.27%;不完全型(imperfect)12个,占13.48%;复合型(compound)2个,占2.... 采用磁珠富集法,以生物素标记的(CA)12寡核苷酸为探针,构建了日本蟳基因组微卫星富集文库。通过PCR法从文库中共筛选出89个微卫星位点,其中完全型(perfect)共75个,占84.27%;不完全型(imperfect)12个,占13.48%;复合型(compound)2个,占2.25%。根据微卫星位点的侧翼序列,设计筛选出9对具有稳定多态性的微卫星引物,引物荧光标记后对日本蟳舟山群体进行遗传多样性分析。结果表明,9个微卫星位点的等位基因数为12—25;观察杂合度和期望杂合度分别为0.5806—0.9032和0.8383—0.9449;9个微卫星位点的PIC值为0.8092—0.9259。本研究筛选的9个微卫星位点可作为日本蟳遗传多样性、种群遗传结构等研究的理想分子标记。 展开更多

关键词 日本蟳 微卫星 磁珠富集法 遗传多样性

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用质谱技术结合EST库搜索鉴定厚壳贻贝新型足丝蛋白(英文) 被引量：1

10

作者 孙敬敬 李楠楠 +1 位作者 王信超 廖智 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期75-84,共10页

贻贝利用足丝粘附于水下各种基质表面.作为一种具有优异粘附性能的生物材料,贻贝足丝蛋白在新型水下粘附剂及表面保护涂层的研制与开发中具有重要的仿生学意义.目前,已报道的贻贝足丝蛋白分子达11种,但是仍然有更多的足丝蛋白分子不为人... 贻贝利用足丝粘附于水下各种基质表面.作为一种具有优异粘附性能的生物材料,贻贝足丝蛋白在新型水下粘附剂及表面保护涂层的研制与开发中具有重要的仿生学意义.目前,已报道的贻贝足丝蛋白分子达11种,但是仍然有更多的足丝蛋白分子不为人知.为进一步探讨贻贝足丝蛋白的分子多样性,并从中筛选具有特殊生物学功能的足丝蛋白分子,本文采用鸟枪法-液相色谱-质谱/质谱技术(shotgun-LC-MS/MS)对厚壳贻贝足丝蛋白进行了蛋白质组学分析.将厚壳贻贝足丝分为足丝纤维和足丝盘两部分,每一部分均采用醋酸-尿素溶液,以及醋酸-盐酸胍溶液进行蛋白质抽提;抽提后的足丝蛋白经胰蛋白酶酶解,利用线性离子阱四级杆质谱(LTQ)进行鸟枪法质谱分析.二级质谱图(MS/MS)用以搜索公共数据库中的贻贝表达序列标签(expressed sequence tag,EST)数据库.采用上述方法,获得14种贻贝新型足丝蛋白的高可信度结果及其所匹配的部分或全长cDNA序列;经结构域分析,发现上述新型贻贝足丝蛋白分子的序列中多数包含各种类型的结构域,包括胶原蛋白结构域、C1Q结构域、C1Q结合结构域、微管蛋白辅助折叠结构域、蛋白酶拮抗结构域、VWA结构域、几丁质酶结构域等.在此基础上,对上述新型足丝蛋白在贻贝足丝形成以及粘附方面的功能进行了推测.上述结果对进一步了解贻贝足丝的分子组成以及粘附机理奠定了基础. 展开更多

关键词 厚壳贻贝 足丝蛋白 鸟枪法-液相色谱-质谱 质谱 表达序列标签

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于Illumina测序的厚壳贻贝足组织转录组研究 被引量：2

11

作者 潘齐冬 齐齐 +4 位作者 鲍林飞 秦传利 何建瑜 范美华 廖智 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期872-882,共11页

贻贝足丝是贻贝足组织分泌的足丝蛋白形成的非细胞组织,具有在水环境下的极强粘附性能,是当前生物粘附剂及抗腐蚀材料的研发热点.为进一步了解贻贝足丝蛋白的分子多样性特征,采用新一代Illumina高通量测序平台对厚壳贻贝(Mytilus corusc... 贻贝足丝是贻贝足组织分泌的足丝蛋白形成的非细胞组织,具有在水环境下的极强粘附性能,是当前生物粘附剂及抗腐蚀材料的研发热点.为进一步了解贻贝足丝蛋白的分子多样性特征,采用新一代Illumina高通量测序平台对厚壳贻贝(Mytilus coruscus)足组织进行转录组测序,首次构建了厚壳贻贝足组织的转录组数据库.共计获得7 199 799 840 nt的碱基数据.经过序列拼接和组装,获得88 825条unigene.对上述unigene开展了序列注释,共计37 007条unigene获得注释.在此基础上,经序列检索和比对,从中筛选出与目前已知的11种足丝蛋白同源的56条unigene序列并进行分析.结果表明,厚壳贻贝足丝蛋白具有明显的氨基酸偏好性,部分足丝蛋白具有重复序列,且厚壳贻贝足丝蛋白与其他种类的贻贝足丝蛋白具有较高的序列相似性.上述结果为后续贻贝足丝蛋白的批量鉴定以及在此基础上的贻贝足丝形成、固化以及粘附机制相关研究奠定了基础. 展开更多

关键词 厚壳贻贝 足丝 足丝蛋白 转录组

在线阅读 下载PDF 职称材料

三疣梭子蟹免疫相关基因Cystatin的鉴定与表达分析 被引量：1

12

作者 王京波 孙敬敬 +1 位作者 廖智 申望 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第6期1469-1477,共9页

半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin超家族在机体中参与包括免疫调节在内的多种生理病理功能。通过对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血细胞全长c DNA文库随机测序,鉴定了一个新颖的I型Cystatin基因,命名为Pt Cystatin。Pt Cystatin全... 半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin超家族在机体中参与包括免疫调节在内的多种生理病理功能。通过对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)血细胞全长c DNA文库随机测序,鉴定了一个新颖的I型Cystatin基因,命名为Pt Cystatin。Pt Cystatin全长c DNA 960 bp,开放阅读框372 bp,编码123个氨基酸残基,N端19个氨基酸残基为信号肽。Pt Cystatin成熟肽有104个氨基酸残基,理论分子量为11 640.30 Da,等电点p I为5.24,有一个Cystatin结构域。Pt Cystatin与I型Cystatin序列同源性高,人Cystatin A与靶酶结合的2个基序在PtCystatin中也保守(M26VPGG30,Q71VVAG75),C端无二硫键。组织表达差异分析显示Pt Cystatin在胃中表达量高,其次为肝胰脏、鳃、血细胞,肌肉和眼中表达量低。致病菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)诱导3 h,血细胞Pt Cystatin表达量小幅上调1.21倍(P<0.05);而在6 h和12 h显著下调,分别为0.47倍(P<0.01)和0.57倍(P<0.05);24 h恢复到诱导前水平,提示Pt Cystatin可能参与三疣梭子蟹的免疫防御反应,是一个免疫相关基因。 展开更多

关键词 CYSTATIN 三疣梭子蟹 血细胞 免疫调节

在线阅读 下载PDF 职称材料