通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑...通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术转化酿酒酵母S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1,在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因,获得工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1。实验室黄酒发酵实验结果表明,与亲本菌株S.cerevisiae Na相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了92.1%,EC含量降低了58.6%;与出发菌株S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了43.4%,EC含量降低了16.2%。过表达DUR3的工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1具有“尿素吸收”的能力,减少EC的形成。借助CRISPR/Cas9系统,构建的酵母工程菌无外源抗性基因的引入,具有工业化应用的潜在可能性。展开更多
文摘自行制备了氧化石墨烯/零价纳米铁(GO@nZVI)磁性材料。称取此磁性材料15mg置于小烧杯中,依次用甲醇和水清洗和活化。将经过0.22μm滤膜过滤除去悬浮颗粒物的环境水样10mL加入于磁性材料中,用乙酸和氨水调节其酸度至pH 7.0,振荡5min,使磁性材料对水样中的喹诺酮抗生素充分吸附。用磁铁在烧杯外侧将磁性材料吸引在烧杯底部,弃去上清液,在磁性材料中加入氨水超声洗脱3次,每次用氨水1.0mL。合并洗脱液,并吹氮至近干,用100μL水溶解残留物,所得溶液过0.22μm滤膜过滤,滤液供高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)在仪器工作条件下进行分析。在色谱分离中,选用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱为固定相,和以不同比例的(A)甲醇和(B)1%(体积分数)甲酸溶液的混合液作为流动相进行梯度洗脱,并在电喷雾离子源、正离子(ESI+)模式和多反应监测(MRM)模式条件下进行MS/MS测定。测得12种喹诺酮类抗生素标准曲线的线性范围均在1~50μg·L-1之间,其检出限(3S/N)为1.6~9.6ng·L^-1。其测定值的相对标准偏差(n=5)为3.4%~6.1%(日内)和7.2%~13%(日间)。按标准加入法进行回收试验,测得回收率为90.3%~103%。经扫描电镜(SEM)和红外光谱(FTIR)两种方法对GO@nZVI磁性材料的表征,说明GO已紧密吸附在nZVI的表面;试验还证明此材料经重复使用10次,第10次的萃取回收率比第一次的数值降低约10%,说明此材料可重复利用。
文摘通过代谢工程改造构建低产尿素的酿酒酵母工程菌,从根源上减少黄酒发酵液中尿素的含量及氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,EC)的形成。该研究利用融合PCR构建DUR3过表达组件“HOL-PGK1p-DUR3-PGK1t-HOR”,通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术转化酿酒酵母S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1,在敲除CAR1和过表达DUR1,2基因的基础上过表达DUR3基因,获得工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1。实验室黄酒发酵实验结果表明,与亲本菌株S.cerevisiae Na相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了92.1%,EC含量降低了58.6%;与出发菌株S.cerevisiae Na DUR1,2-Δcar1相比,工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1所酿黄酒发酵液中尿素含量降低了43.4%,EC含量降低了16.2%。过表达DUR3的工程菌S.cerevisiae Na DUR1,2/DUR3-Δcar1具有“尿素吸收”的能力,减少EC的形成。借助CRISPR/Cas9系统,构建的酵母工程菌无外源抗性基因的引入,具有工业化应用的潜在可能性。
