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不同血清群问号钩端螺旋体mce基因序列分析及表达模式的研究 被引量：2
1
作者 张磊 薛峰 +2 位作者 严杰 毛亚飞 李立伟 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期564-571,共8页
目的:确定问号钩端螺旋体(简称钩体)株携带侵袭相关mce基因情况,原核表达mce基因并制备其抗血清,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法:采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序。采用基因... 目的:确定问号钩端螺旋体(简称钩体)株携带侵袭相关mce基因情况,原核表达mce基因并制备其抗血清,了解问号钩体感染细胞前后mce基因转录水平的变化。方法:采用PCR扩增13株问号钩体和1株双曲钩体全长mce基因片段,T-A克隆后测序。采用基因工程技术构建mce基因原核表达系统,SDS-PAGE联合Bio-Rad凝胶图象分析系统检查目的重组蛋白rMce表达情况,采用Western Blot对表达的rMce进行鉴定。采用皮内免疫法制备兔抗rMce血清,免疫双扩散试验测定其效价。采用实时荧光定量RT-PCR,检测问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染J774A.1细胞前后mce基因转录水平的变化。结果:我国13株问号钩体株均携带mce基因,双曲钩体三宝垄群patoc型Patoc株则否。与报道的序列(GenBank accession No.:NP_712236)比较,所克隆的mce基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.02%～100%和97.91%～100%。所构建的mce基因原核表达系统能表达rMce,其产量为细菌总蛋白的5%。问号钩体56601株全菌抗血清能有效识别rMce。问号钩体56601株感染细胞后mce基因转录水平明显上调。结论:mce基因仅存在于致病性的问号钩体中,且其转录水平呈细胞接触上调模式,表明该基因与问号钩体致病性密切相关。mce基因产物是序列保守的外膜蛋白。所构建的mce基因原核表达系统及所制备的rMce抗血清为深入研究该基因功能提供了有效的手段。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号 基因表达 序列分析 DNA mce基因 克隆/表达 实时荧光定量RT—PCR
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问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定 被引量：3
2
作者 姜久昆 林旭瑷 +1 位作者 严杰 薛峰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期585-591,621,共8页
目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增... 目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。 展开更多
关键词 钩端螺旋体 问号/免疫学 细菌外膜蛋白质类/生物合成 细菌外膜蛋白质类/分离 外膜脂蛋白/属特异性抗原 LipL41/1/LipL41/2 抗原表位/预测 噬菌体展示 免疫学鉴定
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问号钩端螺旋体诱导J774A．1细胞凋亡及caspase-3、-6活化对凋亡的影响 被引量：1
3
作者 金丹丹 董海艳 +2 位作者 严杰 李立伟 毛亚飞 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期558-563,共6页
目的:了解问号钩端螺旋体(钩体)诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)凋亡的作用,以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A.1细胞感染模型。采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋... 目的:了解问号钩端螺旋体(钩体)诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)凋亡的作用,以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A.1细胞感染模型。采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况。分别采用荧光比色法和WesternBlot,检测感染细胞caspase-3、-6活性及其底物(PARA和LaminA/C)剪切情况。结果:多种不同浓度的问号钩体赖株感染均可使J774A.1细胞发生凋亡,其中以问号钩体∶细胞=100∶1的比例感染时凋亡率最高(48.81%±5.95%)。感染细胞caspase-3和-6最大活性分别为(1453.41±36.07)FU和(618.65±39.82)FU,是未感染细胞的16.38和9.98倍。感染细胞的PARP和Lamin A/C均被剪切。Caspase-3、-6抑制剂对问号钩体赖株诱导的J774A.1细胞凋亡有明显的阻断作用。结论:问号钩体可诱导J774A.1细胞凋亡,caspase-3和-6与该细胞凋亡密切相关。 展开更多
关键词 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶/代谢 钩端螺旋体 问号/致病力 流式细胞术 细胞凋亡 信号传导/caspase
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