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小鼠pLCK-CD69-IRES-EGFP表达载体构建及CD69转基因小鼠的建立
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作者 王静 胡燕 +5 位作者 谭笔琴 王佳佳 赵梦婷 翁勤洁 朱狄峰 汪慧英 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期511-516,共6页
目的：构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在细胞内核糖体切入位点（IRES）的表达载体pLCK—CD69-IRES—EGFP，并基于此创建CD69转基因小鼠。方法：首先通过小鼠肺组织提取RNA，逆转录成为cDNA，经过PubMed搜... 目的：构建携小鼠细胞表面活化蛋白CD69和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在细胞内核糖体切入位点（IRES）的表达载体pLCK—CD69-IRES—EGFP，并基于此创建CD69转基因小鼠。方法：首先通过小鼠肺组织提取RNA，逆转录成为cDNA，经过PubMed搜索设计PCR引物，PCR法扩增mCD69片断，接着将该DNA片段经测序验证后接入pInsulater—LCK—IRES—EGFP质粒，构建pLCK—CD69-IRES—EGFP转基因载体；再将其转染到293T细胞中，通过荧光显微镜技术确定其在293T细胞中的表达状况；最后将载体显微注射入受精卵并移植入假孕母小鼠，出生小鼠取尾经PCR鉴定获得阳性首建鼠，并通过荧光显微镜和流式细胞术确定淋巴细胞上CD69的表达。结果：经酶切、DNA测序鉴定证实pLCK—CD69-IRES—EGFP表达载体构建成功；荧光倒置显微镜检查证实其在转染的293T细胞内的蛋白表达；小鼠取尾PCR鉴定明确CD69转基因小鼠创建成功；CD69转基因小鼠有外周血淋巴细胞的减少及静息状态下CD69的表达。结论：成功构建pLCK-CD69-IRES—EGFP表达载体及制备CD69转基因小鼠，为CD69在炎症性疾病中作用的整体模型研究奠定了基础。 展开更多
关键词 抗原 核糖体 绿色荧光蛋白质类/代谢 质粒 转染 小鼠 转基因
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