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基于PiggyBac转座子优化稳定表达细胞系的新型瞬时受体电位M2通道抑制剂筛选
1
作者
应凯悦
华宁
+3 位作者
骆燕萍
刘星宇
刘敏
杨巍
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第5期604-614,共11页
目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T,并进行TRPM2通道抑制剂筛选,为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理,构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒...
目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T,并进行TRPM2通道抑制剂筛选,为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理,构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒共同转染至HEK293T细胞中,利用系统携带的荧光与膜片钳鉴定TRPM2基因表达,通过Z'因子评估细胞模型是否适用于钙成像法的高通量筛选。利用钙成像法和膜片钳对11个先导化合物分子进行初步活性评价,测定化合物分子对TRPM2通道的抑制活性。利用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型和细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法验证筛选得到的化合物分子对损伤细胞的保护作用。利用流式细胞术检测细胞活性氧水平。利用小鼠短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)模型评价化合物的神经保护作用。结果:成功构建pPB-hTRPM2真核表达载体,构建出可高效表达TRPM2基因的HEK293T细胞系,并同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。在筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,所有细胞荧光明亮可见,诱导后细胞表现出经典的TRPM2通道电流特征,TRPM2通道电流值与瞬时转染对照组差异无统计学意义(P>0.05)。该筛选系统进行钙成像实验的Z'因子为0.5416,表明其适用于高通量筛选。通过钙成像法结合膜片钳筛选出化合物6,其具有显著的TRPM2通道抑制作用,且1.0μmol/L的化合物6能够显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),降低活性氧水平(P<0.05),0.3、1.0 mg/kg的化合物6能降低tMCAO小鼠脑梗死体积百分比(均P<0.05)。结论:利用PiggyBac基因编辑技术成功构建了TRPM2基因稳定表达细胞系,利用钙成像法和膜片钳在候选化合物中成功筛选出一个高亲和力的新的TRPM2通道抑制剂。该抑制剂可以通过降低细胞活性氧水平缓解OGD/R后细胞损伤,并对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
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关键词
PiggyBac转座系统
瞬时受体电位M2型
高通量筛选
膜片钳
氧糖剥夺/再灌注损伤
短暂性大脑中动脉栓塞
小鼠
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职称材料
瞬时受体电位M2抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧细胞的保护作用
被引量：
1
2
作者
黄卓群
余夏飞
+5 位作者
刘星宇
马康
黄敏华
李芳芳
杨巍
牛建国
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第1期106-112,共7页
目的:探讨瞬时受体电位M2(TRPM2)抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧(OGD/R)细胞模型的保护作用。方法:采用SH-SY5Y细胞系制备OGD/R损伤模型。将细胞随机分为空白对照组、模型对照组和A10组。细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;活性氧检测试剂...
目的:探讨瞬时受体电位M2(TRPM2)抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧(OGD/R)细胞模型的保护作用。方法:采用SH-SY5Y细胞系制备OGD/R损伤模型。将细胞随机分为空白对照组、模型对照组和A10组。细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧水平;四甲基罗丹明甲酯法检测线粒体膜电位;一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞数量;蛋白质印迹法测定cleaved caspase 3蛋白表达。结果:相对于3、20、30、50和100μmol/L,10μmol/L浓度的A10具有较低的细胞毒性及较好的通道活性抑制作用。与模型对照组比较,A10组活性氧水平降低(P<0.05),线粒体膜电位降低程度改善(P<0.05),凋亡细胞数减少(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved caspase 3表达减少(P<0.05)。结论:A10可以通过抑制TRPM2通道功能、减少细胞外钙离子内流、降低细胞活性氧水平、稳定线粒体膜电位水平和减少细胞凋亡缓解OGD/R后细胞的损伤。
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关键词
瞬时受体电位M2通道
缺糖缺氧/复糖复氧
活性氧
线粒体膜电位
细胞凋亡
Cleaved
caspase
3
SH-SY5Y细胞
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职称材料
题名
基于PiggyBac转座子优化稳定表达细胞系的新型瞬时受体电位M2通道抑制剂筛选
1
作者
应凯悦
华宁
骆燕萍
刘星宇
刘敏
杨巍
机构
浙江大学基础医学院生物物理学系
出处
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第5期604-614,共11页
基金
国家自然科学基金(82030108)
宁夏回族自治区重点研发项目(2019BFH02003)。
文摘
目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T,并进行TRPM2通道抑制剂筛选,为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理,构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒共同转染至HEK293T细胞中,利用系统携带的荧光与膜片钳鉴定TRPM2基因表达,通过Z'因子评估细胞模型是否适用于钙成像法的高通量筛选。利用钙成像法和膜片钳对11个先导化合物分子进行初步活性评价,测定化合物分子对TRPM2通道的抑制活性。利用氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型和细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法验证筛选得到的化合物分子对损伤细胞的保护作用。利用流式细胞术检测细胞活性氧水平。利用小鼠短暂性大脑中动脉栓塞(tMCAO)模型评价化合物的神经保护作用。结果:成功构建pPB-hTRPM2真核表达载体,构建出可高效表达TRPM2基因的HEK293T细胞系,并同时表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。在筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中,所有细胞荧光明亮可见,诱导后细胞表现出经典的TRPM2通道电流特征,TRPM2通道电流值与瞬时转染对照组差异无统计学意义(P>0.05)。该筛选系统进行钙成像实验的Z'因子为0.5416,表明其适用于高通量筛选。通过钙成像法结合膜片钳筛选出化合物6,其具有显著的TRPM2通道抑制作用,且1.0μmol/L的化合物6能够显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率(P<0.05),降低活性氧水平(P<0.05),0.3、1.0 mg/kg的化合物6能降低tMCAO小鼠脑梗死体积百分比(均P<0.05)。结论:利用PiggyBac基因编辑技术成功构建了TRPM2基因稳定表达细胞系,利用钙成像法和膜片钳在候选化合物中成功筛选出一个高亲和力的新的TRPM2通道抑制剂。该抑制剂可以通过降低细胞活性氧水平缓解OGD/R后细胞损伤,并对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
关键词
PiggyBac转座系统
瞬时受体电位M2型
高通量筛选
膜片钳
氧糖剥夺/再灌注损伤
短暂性大脑中动脉栓塞
小鼠
Keywords
PiggyBac transposition system
Transient receptor potential melastatin 2
High-throughput screening
Patch clamp
Oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury
Transient middle cerebral artery occlusion
Mice
分类号
Q189 [生物学—神经生物学]
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职称材料
题名
瞬时受体电位M2抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧细胞的保护作用
被引量：
1
2
作者
黄卓群
余夏飞
刘星宇
马康
黄敏华
李芳芳
杨巍
牛建国
机构
宁夏医科
大学
宁夏颅脑疾病重点实验室
浙江大学基础医学院生物物理学系
宁夏医科
大学
基础
医学院
人体解剖与组织胚胎学
系
出处
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第1期106-112,共7页
基金
宁夏回族自治区重点研发(东西部合作)项目(2019BFH02003)。
文摘
目的:探讨瞬时受体电位M2(TRPM2)抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧(OGD/R)细胞模型的保护作用。方法:采用SH-SY5Y细胞系制备OGD/R损伤模型。将细胞随机分为空白对照组、模型对照组和A10组。细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧水平;四甲基罗丹明甲酯法检测线粒体膜电位;一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞数量;蛋白质印迹法测定cleaved caspase 3蛋白表达。结果:相对于3、20、30、50和100μmol/L,10μmol/L浓度的A10具有较低的细胞毒性及较好的通道活性抑制作用。与模型对照组比较,A10组活性氧水平降低(P<0.05),线粒体膜电位降低程度改善(P<0.05),凋亡细胞数减少(P<0.05),凋亡相关蛋白cleaved caspase 3表达减少(P<0.05)。结论:A10可以通过抑制TRPM2通道功能、减少细胞外钙离子内流、降低细胞活性氧水平、稳定线粒体膜电位水平和减少细胞凋亡缓解OGD/R后细胞的损伤。
关键词
瞬时受体电位M2通道
缺糖缺氧/复糖复氧
活性氧
线粒体膜电位
细胞凋亡
Cleaved
caspase
3
SH-SY5Y细胞
Keywords
Transient receptor potential melastatin 2 channel
Oxygen glucose deprivation/reperfusion
Reactive oxygen species
Mitochondrial membrane potential
Apoptosis
Cleaved caspase 3
SH-SY5Y cells
分类号
R743.31 [医药卫生—神经病学与精神病学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
基于PiggyBac转座子优化稳定表达细胞系的新型瞬时受体电位M2通道抑制剂筛选
应凯悦
华宁
骆燕萍
刘星宇
刘敏
杨巍
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2024
0
在线阅读
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职称材料
2
瞬时受体电位M2抑制剂A10对缺糖缺氧后复糖复氧细胞的保护作用
黄卓群
余夏飞
刘星宇
马康
黄敏华
李芳芳
杨巍
牛建国
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2021
1
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职称材料
已选择
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条
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参考文献
引证文献
统计分析
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