sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒的构建和表达及生物学活性鉴定

1

作者 吴茜茜 陈鸿鹄 +2 位作者 郭佳 王圣超 潘建平 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期350-356,共7页

目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定。方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片... 目的:构建表达可溶性血管内皮生长因子受体2(sVEGFR2,在小鼠又称sflk1)与IFN-γ双功能蛋白的重组质粒pcDNA3.1(+)/sflk1-IFN-γ,对表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白的生物学活性进行鉴定。方法:以RT-PCR法分别扩增出sflk1与小鼠IFN-γ基因片段,克隆入pcDNA3.1(+)载体,将该重组质粒表达于真核细胞,以ELISA和W estern blotting分别检测胞外及胞内sflk1-IFN-γ双功能重组蛋白的表达,并对该蛋白的生物学活性进行鉴定。结果:构建的pcDNA3.1(+)/sflk1-IFNγ-重组质粒能够在真核细胞中有效表达,且表达的sflk1-IFN-γ重组蛋白兼有sflk1和IFN-γ两者的生物学活性。结论:成功构建和表达了sflk1-IFN-γ双功能蛋白基因重组质粒,为进一步研究该双功能蛋白的抗肿瘤作用打下了基础。 展开更多

关键词 蛋白质类/遗传学 血管内皮生长因子受体2/遗传学 sflk-1 IFN-γ 双功能蛋白 基因重组

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病原菌耐药信号传导机制及多抗原肽疫苗研究进展与发展趋势 被引量：12

2

作者 孙爱华 方佳琪 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期125-130,共6页

细菌耐药性是当前人类面临的重大医学问题之一。接种疫苗是预防各种传染病最为经济和有效的措施,也是预防和控制耐药性病原菌感染相关传染病的有效途径。文中介绍了病原菌耐药相关信号传导机制及新型多抗原肽疫苗研究进展,并分析了其发... 细菌耐药性是当前人类面临的重大医学问题之一。接种疫苗是预防各种传染病最为经济和有效的措施,也是预防和控制耐药性病原菌感染相关传染病的有效途径。文中介绍了病原菌耐药相关信号传导机制及新型多抗原肽疫苗研究进展,并分析了其发展趋势,以供相关领域研究者参考。 展开更多

关键词 大肠杆菌 沙门菌 甲型副伤寒 副结核分枝杆菌 细菌菌苗 肽类 抗药性 细菌 药物耐受性 病原菌 耐药性 疫苗

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病原菌对NOD样受体及Toll样受体信号通路介导的固有免疫逃逸机制研究进展 被引量：7

3

作者 何玉洁 潘建平 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期218-224,共7页

作为机体抵抗病原微生物的第一道防线,固有免疫细胞通过模式识别受体(PRR)识别病原体相关模式分子(PAMP)继而启动下游信号通路,以发挥固有免疫效应,清除入侵的病原体和异物。固有免疫细胞主要的信号通路有NOD样受体(NLR)及Toll样受体(T... 作为机体抵抗病原微生物的第一道防线,固有免疫细胞通过模式识别受体(PRR)识别病原体相关模式分子(PAMP)继而启动下游信号通路,以发挥固有免疫效应,清除入侵的病原体和异物。固有免疫细胞主要的信号通路有NOD样受体(NLR)及Toll样受体(TLR)信号通路,病原菌经过长期的选择进化产生了针对NLR及TLR信号通路的对抗机制,以利于其在宿主体内的生存增殖。病原菌主要通过产生毒力因子或降低刺激炎症小体活化的PAMP的表达,干扰、抑制或避免固有免疫细胞内炎症小体的活化,实现对NLR介导的信号通路的免疫逃逸。而对TLR信号通路的免疫逃逸主要通过产生毒力因子,抑制丝裂原活化蛋白激酶级联反应、抑制NF-kB活化以及通过产生含有TIR结构域的蛋白,直接与TLR或者TLR信号通路中的接头蛋白结合,干扰下游信号转导三种机制。 展开更多

关键词 细菌 免疫 天然 Toll样受体/免疫学 膜糖蛋白类/免疫学 信号转导 受体 模式识别 受体 细胞表面 综述

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梅毒螺旋体重组蛋白rTpN17或rTpN47为抗原的ELISA与TRUST和TPHA血清学检测效果的比较 被引量：9

4

作者 孙爱华 范兴丽 +3 位作者 毛亚飞 彭敏峰 范春红 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第1期67-72,共6页

目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpn17、tpn47基因原核表达系统,建立基于rTpN17、rTpN47的ELISAs,并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法:采用PCR扩增tpn17和tpn47基因并构建tpn17和tpn47基因原核表达系统。采用SDS-PAGE... 目的:克隆并构建梅毒螺旋体tpn17、tpn47基因原核表达系统,建立基于rTpN17、rTpN47的ELISAs,并对其用于梅毒血清学诊断的敏感性和特异性进行评价。方法:采用PCR扩增tpn17和tpn47基因并构建tpn17和tpn47基因原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rTpN17和rTpN47表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rTpN17和rTpN47,Western blot检测rTpN17和rTpN47免疫反应性。分别以rTpN17和rTpN47为包被抗原,建立检测血清标本中梅毒抗体的ELISAs(rTpN17-ELISA和rTpN47-ELISA),检测200例健康人、25例类风湿关节炎(RA)和17例系统性红斑狼疮(SLE)患者血清样本,并与甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)和梅毒螺旋体间接血凝试验(TPHA)检测效果进行比较。结果:克隆的tpn17和tpn47基因与GenBank中相关序列相似性为100%。rTpN17和rTpN47表达量分别为细菌总蛋白的37.2%和26.8%。提纯后的rTpN17和rTpN47能与梅毒抗体阳性血清发生明显的结合反应。TPHA检测阳性率最高(99.1%,P<0.001),rTpN17-ELISA和rTpN47-ELISA检测阳性率相近(85.3%和84.3%,P=0.427),TRUST检测阳性率低于rTpN17-ELISA(P=0.001),但与rTpN47-ELISA相近(P=0.014)。所有健康人血清、RA和SLE患者血清标本的rTpN17-ELISA、rTpN47-ELISA和TPHA检测结果均为阴性,但有7.1%(3/42)RA和SLE患者血清标本TRUST检测结果阳性。结论:以rTpN17和rTpN47为抗原的ELISAs可作为快速、简便、敏感性和特异性较高的梅毒血清学筛查方法,而且rTpN17和rTpN47仍保持原有免疫反应特异性。 展开更多

关键词 酶联免疫吸附测定/方法 梅毒 密螺旋体 苍白/免疫学 敏感性与特异性 基因表达 抗原 细菌/血液 梅毒血清诊断/方法 免疫显性表位/生物合成 免疫显性表位/遗传学 重组 遗传

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肺炎链球菌ciaH/R基因重组表达及CiaH/R与β-内酰胺类耐药相关性 被引量：9

5

作者 孙爱华 樊欢 +2 位作者 夏肖萍 李向阳 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期605-611,共7页

目的:构建肺炎链球菌ciaH和ciaR基因的原核表达系统,探讨CiaH和CiaR封闭后细菌耐药性变化。方法:采用PCR扩增全长ciaH和ciaR基因,以常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaH和... 目的:构建肺炎链球菌ciaH和ciaR基因的原核表达系统,探讨CiaH和CiaR封闭后细菌耐药性变化。方法:采用PCR扩增全长ciaH和ciaR基因,以常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaH和rCiaR表达量。制备rCiaH和rCiaR兔抗血清及其IgG。检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后,细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化。结果:与报道序列比较,所克隆的ciaH和ciaR基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%～100%和100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ciaH和E.coli BL21DE3pET42a-ciaR能高效表达目的重组蛋白rCiaH和rCiaR,其产量分别高达细菌总蛋白的33%和45%。rCiaH、rCiaR抗血清及其IgG免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶1、1∶1。CiaH-IgG胞外或胞内封闭CiaH、CiaR-IgG胞内封闭CiaR后,青霉素及头孢噻肟敏感菌株可出现对两种抗生素的耐药性,但对耐药菌株耐药性无明显影响。结论:成功地构建了肺炎链球菌ciaH/ciaR基因原核表达系统,为深入研究该TCS与耐药性关系奠定了基础。CiaH和CiaR均与肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟耐药性有关。 展开更多

关键词 链球菌 肺炎/药物作用 基因 细菌 β内酰胺抗药性 二元信号传导系统 ciaH/ciaR基因 Β-内酰胺类抗生素 耐药性

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2013年杭州市手足口病患儿及其接触人群流行病学调查 被引量：26

6

作者 周俊 吴亦栋 +2 位作者 陈晓玲 宋超 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第2期212-217,共6页

目的：了解2013年杭州市手足口病（ HFMD）流行特征、不同HFMD病原体与疾病严重程度关系以及人肠道病毒71型（ HEV71）阳性重症HFMD患儿接触人群HEV71携带率。方法：采集2013年杭州市儿童医院收治的HFMD疑似患儿咽拭子或粪便标本，采用... 目的：了解2013年杭州市手足口病（ HFMD）流行特征、不同HFMD病原体与疾病严重程度关系以及人肠道病毒71型（ HEV71）阳性重症HFMD患儿接触人群HEV71携带率。方法：采集2013年杭州市儿童医院收治的HFMD疑似患儿咽拭子或粪便标本，采用实时荧光定量PCR检测HFMD病原体，了解轻症和重症HFMD患儿中HFMD病原体的分布。选取54例HEV71阳性重症HFMD患儿家属中密切接触和一般接触者各1名，检测其粪便标本中的HEV71并随访1个月。分析杭州市儿童医院2011～2013年检出的HFMD病原体构成比差异和优势病原体转变。结果：849例HFMD疑似患儿中确诊641例，男女患儿比例1．4∶1，1～3岁患儿占80．3％。 HFMD患儿标本中24．3％（156/641）检出HEV71，4．7％（30/641）检出A组16型柯萨奇病毒（CVA16），71．0％（455/641）检出其他肠道病毒。75．6％（118/156）HEV71感染病例为重症HFMD，但CVA16和其他HFMD病毒感染病例中仅分别有13．3％（4/30）和6．2％（28/455）为重症HFMD，三者间差异有统计学意义（χ2＝43．28， P ＜0．05）。2011、2012年 HFMD 优势病原体为HEV71，2013年为其他肠道病毒。54例密切接触者和54例一般接触者中分别有9例和10例检出HEV71（ P＞0．05），且均无HFMD临床表现。结论：2013年杭州市HFMD流行季节、好发年龄与性别无明显变化，HEV71感染易引发重症HFMD，但其他肠道病毒已替代HEV71成为HFMD优势病原体。 展开更多

关键词 手足口病 流行病学 手足口病 病因学 感染 浙江 流行病学

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细菌药物钝化酶基因分布及其表达诱导与抑制机制的研究 被引量：6

7

作者 吴亦斐 孙爱华 +2 位作者 赵金方 葛玉梅 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期131-140,共10页

目的:了解临床常见病原菌药物钝化酶基因及其优势基因携带模式,抗生素诱导药物钝化酶基因表达上调的作用及其与细菌组氨酸激酶的关系。方法:采用PCR和测序法,了解金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌... 目的:了解临床常见病原菌药物钝化酶基因及其优势基因携带模式,抗生素诱导药物钝化酶基因表达上调的作用及其与细菌组氨酸激酶的关系。方法:采用PCR和测序法,了解金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、阴沟肠杆菌临床菌株携带的β-内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类钝化酶基因。采用实时荧光定量RT-PCR,了解抗生素诱导及组氨酸激酶阻断剂氯氰碘柳胺抑制药物钝化酶基因表达的作用。结果:63株大肠埃希菌中检出4种β-内酰胺类、2种氨基糖苷类和1种大环内酯类钝化酶基因,优势基因携带模式为[TEM+CTX-M]+aac(3)-Ⅱ+mphA 16株(25.4%)和[TEM+CTX-M]+aac(6')-Ⅰb 13株(20.6%)。24株金黄色葡萄球菌中检出2种β-内酰胺类、3种氨基糖苷类钝化酶基因,优势基因携带模式为aph(3')(41.7%)或aac(6)-Ⅰe-aph(2)-Ⅰa(25.0%)。28株肺炎克雷伯菌中检出4种β-内酰胺酶、2种氨基糖苷类钝化酶基因,优势基因携带模式为[TEM+SHV]+[aac(6')-Ⅰb+aac(3)-Ⅱ](28.6%)和[TEM+SHV]+[aac(6')-Ⅰb+aac(3)-Ⅱ]+mphA(17.8%)。鲍曼不动杆菌和阴沟肠杆菌也以携带两类或三类药物钝化酶基因为优势模式。1/4 MIC青霉素、头胞噻肟和链霉素,能诱导3种β-内酰胺类和4种氨基糖苷类钝化酶基因表达显著上调(P<0.05),该诱导作用可被氯氰碘柳胺所抑制(P<0.05)。结论:上述临床常见病原菌多携带多类药物钝化酶基因并存在不同的优势基因携带模式。低浓度抗生素可能诱导药物钝化酶基因表达上调,但可被组氨酸激酶阻断剂所抑制。 展开更多

关键词 抗药性 细菌 遗传学 药物耐受性 基因型 基因表达 聚合酶链反应 细菌 耐药基因 检测 药物钝化酶 表达 调控机制

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问号钩端螺旋体lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因原核表达及其产物免疫原性分析 被引量：4

8

作者 罗冬娇 邱晓枫 +4 位作者 王江 严谨 王海斌 周金成 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期599-604,共6页

目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原... 目的:构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,优化目的产物表达条件并对表达产物免疫原性进行鉴定。方法:采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因,并用常规基因工程方法建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统,检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2表达量。采用免疫双扩散试验及WesternBlot,鉴定rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2的免疫原性。结果:获得了序列正确的lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统E.coliBL21DE-3pET42a-lipL32/1-lipL21-ompL1/2。表达条件优化后的rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2产量为37.78mg/L,是优化前的3.7倍。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2兔抗血清免疫双扩效价为1∶4。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2抗血清能识别rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2以及rLipL32/1、rLipL21、rOmpL1/2。rLipL32/1-LipL21-OmpL1/2能与问号钩体56601株全菌兔抗血清以及黄疸出血群、流感伤寒群、波摩那群、秋季群问号钩体感染患者血清出现阳性杂交信号。结论:成功地构建了lipL32/1-lipL21-OmpL1/2融合基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及通用型钩体病血清学检测的抗原。 展开更多

关键词 钩端螺旋体 问号 抗原 细菌/分析 聚合酶链反应/方法 属特异性抗原 lipL32基 因/lipL21基因/OmpL1/2 融合基因/构建 原核表达 免疫原性/鉴定

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甲型副伤寒杆菌pagC基因分布及其重组表达产物免疫保护作用 被引量：4

9

作者 张佳 范欣丽 +2 位作者 葛玉梅 严杰 孙爱华 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期171-176,231,共7页

目的:了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性,确定甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核重组表达产物rPagC免疫原性和保护作用。方法:采用PCR及其产物测序了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性。构建甲... 目的:了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性,确定甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核重组表达产物rPagC免疫原性和保护作用。方法:采用PCR及其产物测序了解甲型副伤寒沙门菌临床菌株pagC基因携带率及序列保守性。构建甲型副伤寒沙门菌pagC基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯表达的rPagC。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测rPagC表达情况及其产量。采用免疫扩散法、ELISA和Western Blot鉴定其抗原性和免疫反应性。采用小鼠感染模型了解rPagC对甲型副伤寒杆菌感染的免疫保护效果,微量肥达试验检测rPagC免疫小鼠血清凝集伤寒和副伤寒沙门菌的效果。结果:所有被检测的甲型副伤寒沙门菌临床菌株均携带pagC基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.1%～100%和98.4%～100%。所构建的原核表达系统能高效表达rPagC。rPagC免疫家兔可产生高效价抗体并能与甲型副伤寒杆菌全菌抗血清产生阳性Western杂交信号。ELISA结果显示,97.1%(66/68)甲型副伤寒患者血清标本rPagC抗体阳性。100μg和200μg rPagC对感染小鼠的免疫保护率分别为73.3%(11/15)和86.7%(13/15)。rPagC免疫小鼠血清对甲型副伤寒沙门菌和伤寒沙门菌H抗原凝集效价高达1∶10～1∶40。结论:pagC基因在甲型副伤寒沙门菌株中分布广泛。rPagC有良好的免疫原性及较强的免疫保护作用,可作为甲型副伤寒杆菌基因工程疫苗候选抗原。 展开更多

关键词 沙门菌 甲型副伤寒 免疫学 沙门菌 甲型副伤寒 遗传学 基因表达调控 细菌 重组 遗传 基因表达 pagC基因 重组表达 免疫原性 免疫保护性

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问号钩端螺旋体诱导J774A．1细胞FasL／Fas表达上调及FasL／Fas相关细胞凋亡的研究 被引量：4

10

作者 李世军 胡野 +2 位作者 严杰 毛亚飞 李立伟 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期551-557,共7页

目的:了解FasL/Fas途径参与问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导细胞凋亡及其FasL/Fas表达水平变化。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核-巨噬细胞J774A.1模型。采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征... 目的:了解FasL/Fas途径参与问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导细胞凋亡及其FasL/Fas表达水平变化。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株感染小鼠单核-巨噬细胞J774A.1模型。采用DAPI染色法观察问号钩体56601株感染细胞凋亡的形态学特征,流式细胞术定量检测感染细胞的凋亡率及FasL中和抗体对细胞凋亡的阻断作用。PE标记抗小鼠FasL或Fas单克隆抗体染色法,观察问号钩体56601株感染细胞FasL/Fas表达情况。采用流式细胞术定量检测感染细胞的FasL/Fas表达水平。结果:问号钩体56601株感染J774A.1细胞4h时,部分细胞出现染色质浓缩及边缘化现象;感染24h时上述病变现象更加明显且有部分细胞核裂解。问号钩体56601株感染J774A.1细胞4h和24h的凋亡率分别为53.6%和64.31%。FasL中和抗体预处理细胞后,问号钩体56601株感染细胞4h或24h的凋亡率分别为10.27%和15.90%。J774A.1细胞被问号钩体56601株感染后4和24h,FasL表达率分别从感染前的4.19%上升至21.69%和65.70%,Fas表达率分别从感染前的12.88%上升至91.96%和88.01%。结论:诱导细胞凋亡是问号钩体56601株损伤J774A.1细胞的重要机制。问号钩体可上调靶细胞FasL/Fas表达水平,并通过FasL/Fas途径诱导J774A.1细胞凋亡。 展开更多

关键词 钧端螺旋体 问号/致病力 细胞凋亡 基因表达 J774A.1细胞 FasL/Fas 调控

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肺炎链球菌comD/E/C基因重组表达及ComD/C与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性 被引量：4

11

作者 樊欢 孙爱华 +2 位作者 夏肖萍 孙琦 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期276-282,共7页

目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS... 目的：构建肺炎链球菌调控感受态形成的二元信号传导系统（TCS）基因comD/comE/comC的原核表达系统,探讨ComD和ComC封闭后细菌耐药性变化。方法：采用PCR扩增全长comD、comE和comC基因,并用常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图像分析系统检测目的重组蛋白rComD、rComE和rComC表达量。免疫家兔制备rComD、rComE和rComC抗血清。检测肺炎链球菌菌株ComD和ComC被抗血清封闭后对青霉素和头孢胺噻耐药性的变化。结果：与报道序列比较,所克隆的comD、comE和comC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.4%-99.3%和99.1%-100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-comD、E.coliBL21DE3pET42a-comE和E.coli BL21DE3pET32a-comC能有效表达目的重组蛋白rComD、rComE和rComC,其产量分别为细菌总蛋白的28%、25%和35%。rComD、rComE和rComC抗血清免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶8。ComD和/或ComC被抗血清封闭后,头孢胺噻敏感菌株可出现耐药性,但耐药菌株耐药性无明显改变,也不影响各菌株对青霉素的耐药性。结论：本研究成功地构建了肺炎链球菌comD/come/comC基因原核表达系统,为深入研究感受态形成相关TCS与耐药性关系奠定了基础。ComD和ComC与肺炎链球菌对头孢胺噻耐药性有关。 展开更多

关键词 链球菌 肺炎/遗传学 聚合酶链反应 信号传导 Β内酰胺酶类 抗药性 细菌 基因表达 重组蛋白质类 基因表达调控 细菌

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问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白LipL41抗原表位预测及免疫学鉴定 被引量：3

12

作者 姜久昆 林旭瑷 +1 位作者 严杰 薛峰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期585-591,621,共8页

目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增... 目的:预测及筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白LipL41有效T和B细胞(T/B)联合表位,了解不同基因型LipL41s差异T/B联合表位的免疫反应性差别。方法:采用生物信息学方法预测LipL41/1和LipL41/2分子中T/B联合表位。采用PCR扩增候选T/B联合表位片段,采用噬菌体展示及SDS-PAGE等技术获得含不同T/B联合表位的重组P。分别以rLipL41/1和rLipL41/2抗血清、黄疸出血群赖型赖株全菌抗血清和钩体患者血清为一抗,采用Western Blot检测各抗血清与各重组P免疫杂交反应性。结果:根据预测结果选择了LipL41s中8个共有或差异T/B联合表位。经PCR扩增获得了上述T/B联合表位片段。各T/B联合表位片段均准确插入噬菌体P蛋白N端并有效表达。各抗血清均能识别上述8个T/B联合表位,但其WesternBlot杂交信号强度存在差异,其中共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233与不同抗血清的信号较强且稳定。结论:所选择的8个T/B联合表位均为LipL41的有效抗原表位。共有T/B联合表位LipL41/1-30和LipL41/1-233可作为钩体MAP疫苗的首选抗原表位。差异T/B联合表位LipL41s-89和LipL41s-299与不同抗血清有免疫交叉现象。 展开更多

关键词 钩端螺旋体 问号/免疫学 细菌外膜蛋白质类/生物合成 细菌外膜蛋白质类/分离 外膜脂蛋白/属特异性抗原 LipL41/1/LipL41/2 抗原表位/预测 噬菌体展示 免疫学鉴定

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肠道杆菌耐药性及其耐药相关Ⅰ类整合子可变区结构与进化 被引量：2

13

作者 王欢 包其郁 +3 位作者 孙爱华 赵金方 葛玉梅 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期149-155,共7页

目的:了解大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌临床菌株耐药性,及其Ⅰ类整合子分布、可变区耐药基因盒与分子进化关系。方法:采用K-B法检测大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌对12种药物的敏感性。采用PCR及其产物测序检测上述菌... 目的:了解大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌临床菌株耐药性,及其Ⅰ类整合子分布、可变区耐药基因盒与分子进化关系。方法:采用K-B法检测大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌对12种药物的敏感性。采用PCR及其产物测序检测上述菌株中Ⅰ类整合子携带率及可变区耐药基因盒。采用Clustal X和MEGA软件分析Ⅰ类整合子基因盒中耐药基因分子进化关系。结果:鲍曼不动杆菌对临床常用青霉素类和头孢菌素类抗生素耐药率为54.2%～100%,大肠埃希菌和阴沟肠杆菌对菌素类抗生素耐药率也高达41.6%～62.5%。62.5%(15/24)大肠埃希菌、67.9%(19/28)阴沟肠杆菌、83.3%(20/24)鲍曼不动杆菌检出Ⅰ类整合子,81.5%(44/54)Ⅰ类整合子呈现为4种单条带谱型,其余为3种双条带谱型。Ⅰ类整合子可变区耐药基因盒中存在aac(6')、sad(3″)、aad(2″)、cat(4')和dfr(7、A13和15)耐药基因,可分别介导细菌对氨基糖苷类、氯霉素和磺胺类抗生素耐药。根据二氢叶酸还原酶基因序列差异,上述菌株携带的Ⅰ类整合子可分成4个分子进化组。结论:上述肠道杆菌耐药情况严重并携带高含多种耐药基因盒的Ⅰ类整合子,Ⅰ类整合子有4条不同的进化途径。 展开更多

关键词 肠杆菌属 药物作用 鲍氏不动杆菌 药物作用 埃希氏菌属 药物作用 抗药性 细菌 肠道杆菌 耐药 整合子 耐药基因盒 进化

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胃复春片对幽门螺杆菌抑制作用的实验研究 被引量：28

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作者 陈岩 王杭勇 严杰 《浙江临床医学》 2008年第7期907-908,共2页

关键词 幽门螺杆菌 胃复春片 实验研究 抑制作用 临床治疗 体外试验 临床意义 HP

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fliY基因在空肠弯曲菌致病性相关趋化和定植中的作用 被引量：1

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作者 楼宏强 葛玉梅 +2 位作者 张金良 严杰 赵金方 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期141-148,共8页

目的:构建空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)鞭毛马达开关蛋白FliY编码基因(fliY)敲除突变株,了解FliY蛋白控制细菌鞭毛运动的作用及其与细菌趋化和定植的关系。方法:采用pBluescript-Ⅱ-SK质粒构建用于敲除空肠弯曲菌NCTC11168株fliY... 目的:构建空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)鞭毛马达开关蛋白FliY编码基因(fliY)敲除突变株,了解FliY蛋白控制细菌鞭毛运动的作用及其与细菌趋化和定植的关系。方法:采用pBluescript-Ⅱ-SK质粒构建用于敲除空肠弯曲菌NCTC11168株fliY基因的自杀质粒。根据同源交换原理,利用自杀质粒构建空肠弯曲菌fliY基因敲除突变株(fliY-)。采用PCR、PCR产物测序与Western Blot,对fliY-突变株进行鉴定。采用体外菌落迁徙试验、细菌趋化试验以及小鼠空肠定植试验,检测fliY-突变株趋化和定植能力。结果:fliY-突变株生长曲线与野生株相似,但PCR与测序及Western Blot结果显示,fliY-突变株中fliY基因已被敲除。与野生株比较,fliY-突变株半固体平板上菌落明显较小(P<0.05),对脱氧胆酸钠和牛胆汁趋化能力显著下降(P<0.05),在感染小鼠空肠组织标本中的细菌数(CFU)也明显减少(P<0.05)。结论:空肠弯曲菌fliY基因功能与调控鞭毛运动作用有关,从而对细菌趋化和定植过程产生重大影响。 展开更多

关键词 弯曲杆菌 空肠 致病力 小鼠 基因敲除 鞭毛 聚合酶链反应 印迹法 蛋白质 鞭毛马达开关蛋白 运动力 趋化 定植

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fliR基因与问号钩端螺旋体黏附及损伤细胞功能相关性的研究 被引量：1

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作者 阮萍 王欣莹 +2 位作者 孙爱华 李世军 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期572-578,共7页

目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性。方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA... 目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)fliR基因的致病性。方法:分别从问号钩体黄疸出血群56601株DNA和pET42a质粒中扩增fliR基因和kana基因。构建fliR基因自杀质粒,并设计和合成特异性siRNA。采用分别基于自杀质粒的基因敲除、基于siRNA的基因沉默技术构建问号钩体fliR基因突变株,并用PCR、测序、半定量RT-PCR进行鉴定。采用小鼠单核-巨噬细胞J774A.1黏附试验和流式细胞术,检测敲除fliR基因的问号钩体突变株56601fliR-Kana、siRNA阻断fliR基因的问号钩体突变株56601siRNA-R2株黏附细胞,及诱导细胞坏死或凋亡能力的变化。结果:所克隆的fliR基因与GenBank中相应基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%和100%,所克隆的kana基因核苷酸序列与pET42a图谱完全相同。56601fliR-Kana可在含氨苄青霉素和卡那霉素的EMJH培养基中生长,PCR和测序结果证实56601fliR-Kana株fliR基因中插入了kana基因。56601fliR-Kana株fliR基因mRNA水平明显下降(P<0.01),56601siRNA-R2株fliR基因mRNA水平也低于野生株(P<0.05)。56601fliR-Kana和56601siRNA-R2黏附J774A.1细胞的能力基本消失,诱导J774A.1细胞坏死或凋亡的能力也明显减弱(P<0.01)。结论:fliR基因是问号钩体毒力相关基因,其功能与问号钩体黏附细胞、诱导细胞凋亡或坏死密切相关。 展开更多

关键词 钩端螺旋体 问号/致病力 基因表达 细胞凋亡 Ⅲ型分泌系统 fliR基因 黏附 坏死

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Toll样受体在抗白假丝酵母菌感染中的作用研究进展 被引量：3

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作者 周云 潘建平 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第3期302-307,共6页

Toll样受体（TLR）是一类主要表达于树突状细胞和巨噬细胞等固有免疫细胞上的模式识别受体，能识别和结合白假丝酵母菌上的病原相关分子模式，并引起特定下游信号转导。TLR多态性与宿主对白假丝酵母菌的易感性有关，TLR激活后可诱导促... Toll样受体（TLR）是一类主要表达于树突状细胞和巨噬细胞等固有免疫细胞上的模式识别受体，能识别和结合白假丝酵母菌上的病原相关分子模式，并引起特定下游信号转导。TLR多态性与宿主对白假丝酵母菌的易感性有关，TLR激活后可诱导促炎性细胞因子的表达，发挥抗白假丝酵母菌感染作用；而白假丝酵母菌也可发生菌相改变以利于逃选机体免疫反应。了解TLR和白假丝酵母菌之间的相互作用，可为阐明抗真菌感染免疫的机制提供新的实验依据。 展开更多

关键词 TOLL样受体 念珠菌 白色/药物作用 细胞因子类 感染/药物疗法 综述

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问号钩端螺旋体诱导J774A．1细胞凋亡及caspase-3、-6活化对凋亡的影响 被引量：1

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作者 金丹丹 董海艳 +2 位作者 严杰 李立伟 毛亚飞 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期558-563,共6页

目的:了解问号钩端螺旋体(钩体)诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)凋亡的作用,以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A.1细胞感染模型。采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋... 目的:了解问号钩端螺旋体(钩体)诱导小鼠单核-巨噬样细胞(J774A.1)凋亡的作用,以及caspase-3、-6活化对凋亡的影响。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株J774A.1细胞感染模型。采用FITC-Annexin V/PI荧光标记流式细胞术检测细胞凋亡或坏死情况。分别采用荧光比色法和WesternBlot,检测感染细胞caspase-3、-6活性及其底物(PARA和LaminA/C)剪切情况。结果:多种不同浓度的问号钩体赖株感染均可使J774A.1细胞发生凋亡,其中以问号钩体∶细胞=100∶1的比例感染时凋亡率最高(48.81%±5.95%)。感染细胞caspase-3和-6最大活性分别为(1453.41±36.07)FU和(618.65±39.82)FU,是未感染细胞的16.38和9.98倍。感染细胞的PARP和Lamin A/C均被剪切。Caspase-3、-6抑制剂对问号钩体赖株诱导的J774A.1细胞凋亡有明显的阻断作用。结论:问号钩体可诱导J774A.1细胞凋亡,caspase-3和-6与该细胞凋亡密切相关。 展开更多

关键词 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶/代谢 钩端螺旋体 问号/致病力 流式细胞术 细胞凋亡 信号传导/caspase

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问号钩端螺旋体对主要细胞外基质分子黏附作用及其差异性研究 被引量：1

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作者 张皓 孙爱华 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期579-584,共6页

目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对细胞外基质(ECM)分子的黏附作用及其差异。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A.1、L929和Vero细胞感染模型,采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法,了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效... 目的:了解问号钩端螺旋体(简称钩体)对细胞外基质(ECM)分子的黏附作用及其差异。方法:建立问号钩体黄疸出血群赖型56601株对J774A.1、L929和Vero细胞感染模型,采用Fontana镀银染色法及显微镜检查法,了解问号钩体56601株黏附细胞ECM的效果。建立多种ELISAs,检测问号钩体56601株黏附ECM分子层粘连蛋白(LN)、纤维纤连蛋白(FN)、核心蛋白多糖(DEN)及胶原蛋白1、2、4(COL1,2,4)的作用,采用竞争性抑制试验对上述实验结果进行验证。结果:问号钩体56601株能以一端或两端黏附于L929、J774A.1和Vero细胞的ECM部位。问号钩体56601株可与上述6种ECM分子发生黏附,其中对COL1、LN、COL4的黏附作用较强。问号钩体56601株分别与上述6种ECM分子预孵育后,对相应ECM分子的黏附作用明显下降。结论:ECM是问号钩体黏附宿主细胞的主要部位。LN、FN、DEN、COL1、COL2、COL4均是问号钩体黏附的受体分子,但问号钩体对不同ECM分子的黏附效果有一定差异。 展开更多

关键词 钩端螺旋体 问号/致病力 细胞凋亡 细胞粘附 宿主细胞 细胞外基质

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问号钩端螺旋体致病机制和新型疫苗及细菌耐药性研究进展 被引量：2

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作者 严杰 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2008年第6期537-543,共7页

钩端螺旋体(简称钩体)病是重要的人兽共患传染病之一,但其致病机制至今不明,目前也无可预防所有问号钩体血清群、型感染的通用型疫苗。细菌耐药性一直是医学微生物学和传染病学关注的重大问题之一,近年发现二元信号传导系统(TCS)与某些... 钩端螺旋体(简称钩体)病是重要的人兽共患传染病之一,但其致病机制至今不明,目前也无可预防所有问号钩体血清群、型感染的通用型疫苗。细菌耐药性一直是医学微生物学和传染病学关注的重大问题之一,近年发现二元信号传导系统(TCS)与某些细菌耐药性密切相关。根据近年国内外有关研究资料,文中就问号钩体致病物质及其作用机制、相关信号传导通路及其致病意义以及TCS在肺炎链球菌对青霉素和头孢胺噻耐药性形成、结核分枝杆菌对异烟肼和乙胺丁醇耐药性影响的最新研究进展进行简要介绍。 展开更多

关键词 钩端螺旋体 问号/致病力 致病机制 基因工程疫苗 抗药性 细菌 二元信号传导系统

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