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ELISA法分析HIV-1整合酶的生物学活性 被引量:3
1
作者 冯微宏 黄建松 詹金彪 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2007年第2期179-184,共6页
目的:建立一种能够较好地分析HIV-1整合酶的生物学活性以及大规模地筛选整合酶抑制剂的方法。方法:HIV-1整合酶经表达复性及纯化后,采用一种基于Biotin-Avidin EILSA(BA-ELISA)的方法,使用化学发光底物测定分析整合酶的生物学活性,以及... 目的:建立一种能够较好地分析HIV-1整合酶的生物学活性以及大规模地筛选整合酶抑制剂的方法。方法:HIV-1整合酶经表达复性及纯化后,采用一种基于Biotin-Avidin EILSA(BA-ELISA)的方法,使用化学发光底物测定分析整合酶的生物学活性,以及型核糖体失活蛋白luffin-a对整合酶的抑制作用。结果:1采用BA-ELISA法得到整合酶的比活性为54.92U/mg蛋白;2luffin-a对整合酶的半数抑制浓度为(0.63±0.026)μmol/L。结论:本实验所采用的基于BA-ELISA的方法能够较好地分析HIV-1整合酶的生物活性,适合于大规模体外HIV-1整合酶抑制剂的筛选。 展开更多
关键词 整合酶类/遗传学 人类免疫缺陷Ⅰ型病毒 生物活性 酶联免疫吸附测定
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枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞成熟的影响 被引量:16
2
作者 朱杰 赵鲁杭 陈智 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2006年第6期648-652,共5页
目的:研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表型及功能成熟的影响。方法:小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5 d,然后用免疫磁珠法纯化DC细胞,实验组加入枸杞多糖(100μg/m l),空白对照组加等量RPM I1640,阳性对照组加LPS(100 ng/m l),3... 目的:研究枸杞多糖对小鼠骨髓树突状细胞(DC)表型及功能成熟的影响。方法:小鼠骨髓细胞用GM-CSF和IL-4培养5 d,然后用免疫磁珠法纯化DC细胞,实验组加入枸杞多糖(100μg/m l),空白对照组加等量RPM I1640,阳性对照组加LPS(100 ng/m l),3组分别同时作用48 h。流式细胞仪检测细胞表型和细胞摄取抗原的能力,EL ISA检测产生的细胞因子IL-12,混合淋巴细胞反应检测细胞提呈抗原的能力。结果:用枸杞多糖刺激的小鼠骨髓DC表达I-A/I-E、CD 11c和分泌IL-12能力比空白对照组增加,吞噬F ITC-dextran的能力下降,并可促进同种异基因T细胞的增殖。结论:枸杞多糖可以促进体外培养的小鼠骨髓DC的成熟,促进DC诱导的免疫应答启动。 展开更多
关键词 多糖类/药理学 枸杞多糖 树突细胞 骨髓 细胞 培养的
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活体染毒时藻毒素LR诱导大鼠肝脏P53和Bax蛋白的表达 被引量:3
3
作者 王秀敏 陈加平 +1 位作者 傅文宇 徐立红 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第3期220-222,共3页
 目的:观察活体情况下微囊藻毒素LR暴露对大鼠肝脏P53、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法:SD大鼠灌胃染毒,运用Westernblot检测大鼠肝脏P53、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果:与对照组相比,除了0.1μg/kgLR暴露实验组外,其余各实验组P53和...  目的:观察活体情况下微囊藻毒素LR暴露对大鼠肝脏P53、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法:SD大鼠灌胃染毒,运用Westernblot检测大鼠肝脏P53、Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果:与对照组相比,除了0.1μg/kgLR暴露实验组外,其余各实验组P53和Bax表达都明显升高(P<0.05),而且随着微囊藻毒素LR暴露浓度的升高呈升高趋势;Bcl-2表达没有明显的变化。结论:在活体情况下P53和Bax在微囊藻毒素LR诱导的细胞凋亡中可能起重要作用,而Bcl-2似乎不参与这一过程。 展开更多
关键词 海藻毒素类/毒性 肝/病因学 基因 蛋白质P53 细胞凋亡 原癌基因 大鼠
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蓖麻毒素的提取及其抗肿瘤作用研究 被引量:12
4
作者 邹立波 詹金彪 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第3期217-219,共3页
 目的:研究蓖麻毒素的提取方法和对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:根据Nicolson和Blaustein的方法稍加改良,通过PBS提取、硫酸铵分段盐析、Sephrose4B亲和层析和SephadexG100凝胶过滤等步骤,从去壳蓖麻籽中提取天然蓖麻毒素;采用细胞培养,...  目的:研究蓖麻毒素的提取方法和对肿瘤细胞的杀伤作用。方法:根据Nicolson和Blaustein的方法稍加改良,通过PBS提取、硫酸铵分段盐析、Sephrose4B亲和层析和SephadexG100凝胶过滤等步骤,从去壳蓖麻籽中提取天然蓖麻毒素;采用细胞培养,以MTT法分析不同浓度蓖麻毒素对肿瘤细胞的杀伤作用。结果:用亲和层析和凝胶过滤等步骤提纯的蓖麻毒素,分子量为63kD,由2个亚基组成。细胞毒性分析:蓖麻毒素在高浓度下(5×10-8mol/L~5×10-10mol/L)对正常细胞和结肠癌细胞的杀伤效率无差异(P>0.05),而在低浓度下(5×10-11mol/L~5×10-13mol/L)两者有显著性差异(P<0.01);各种浓度蓖麻毒素对白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480的杀伤作用无统计学上的差别(P>0.05)。结论:蓖麻毒素在低浓度下对肿瘤细胞的杀伤有选择性,对白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480的杀伤作用在各种浓度下无选择性。 展开更多
关键词 蓖麻蛋白/分离和提纯 免疫毒素类/治疗应用 蓖麻蛋白/治疗应用 白血病/治疗 结肠直肠肿瘤/治疗
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壳寡糖激活巨噬细胞的机制 被引量:10
5
作者 韩艳萍 赵鲁杭 吴海明 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2006年第3期265-272,共8页
目的:探讨巨噬细胞结合、内吞壳寡糖以及壳寡糖激活巨噬细胞的机制。方法:利用荧光物质2-氨基吖啶酮标记壳寡糖,在激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞内吞壳寡糖的过程,流式细胞仪分析细胞的荧光强度,通过竞争性抑制实验及钙离子、胰蛋白... 目的:探讨巨噬细胞结合、内吞壳寡糖以及壳寡糖激活巨噬细胞的机制。方法:利用荧光物质2-氨基吖啶酮标记壳寡糖,在激光共聚焦显微镜下观察巨噬细胞内吞壳寡糖的过程,流式细胞仪分析细胞的荧光强度,通过竞争性抑制实验及钙离子、胰蛋白酶、秋水仙碱对内吞的影响来确定巨噬细胞内吞壳寡糖的机制。通过RT-PCR方法检测TNF-α来反映结合及内吞过程对壳寡糖刺激巨噬细胞的影响。结果:巨噬细胞可结合内吞壳寡糖。内吞易受温度影响,37℃较迅速(<2m in),4℃只能结合不能内吞。EDTA可抑制巨噬细胞内吞壳寡糖;经胰蛋白酶预处理的巨噬细胞摄取壳寡糖的能力大大降低,终止胰蛋白酶后巨噬细胞摄取壳寡糖的能力得到恢复。秋水仙碱预处理可明显抑制巨噬细胞摄取壳寡糖,并呈剂量依赖性。0.1 m o l/L甘露糖可抑制壳寡糖对巨噬细胞的刺激作用。结论:甘露糖受体介导的吞饮是巨噬细胞内吞壳寡糖的一条重要途径,甘露糖受体在壳寡糖激活巨噬细胞中起重要作用。 展开更多
关键词 巨噬细胞 肿瘤坏死因子α 寡糖类/药理学 甘露糖 受体 细胞表面 胰蛋白酶/药理学 秋水仙碱/药理学
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微囊藻毒素致毒机理的研究进展 被引量:6
6
作者 傅文宇 徐立红 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2006年第3期342-346,共5页
微囊藻毒素是一种单环七肽毒素,主要由微囊藻产生。近年来有许多研究表明微囊藻毒素能诱导细胞凋亡、氧化应激和线粒体功能的改变,并发现凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白家族和P53在其中起重要作用。
关键词 肽类 环/毒性 细胞凋亡 蛋白质P53 原癌基因蛋白质c—bcl-2 微囊藻属
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蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白基因的融合表达和活性测定 被引量:2
7
作者 陈欣虹 刘琼 詹金彪 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第3期201-206,共6页
 目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白(GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究。方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;...  目的:表达蓖麻毒素A链(RTA)与绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白(GFP-RTA),用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运机理研究。方法:采用PCR法从重组质粒pKK233.2-RTA中扩增出蓖麻毒素A链基因,然而将其插入真核表达质粒pEGFPC1,构成GFP-RTA融合基因;GFP-RTA经PCR扩增,与T载体连接,用内切酶从T-GFP-RTA中切下GFP-RTA片段,插入原核表达质粒pET-28a(+);在BL21(DE3)中表达GFP-RTA融合蛋白,通过金属螯合和层析纯化,MTT法检测融合蛋白的细胞毒性。结果:测序发现插入的融合基因全长序列完全正确,SDS-PAGE鉴定表达产物分子量正确;经诱导表达后,菌体产生绿色荧光,MTT法表明该融合蛋白呈现与RTA相似的细胞毒性。结论:从大肠杆菌表达的蓖麻毒素A链与绿色荧光蛋白的融合蛋白,具有蓖麻毒素A链和绿色荧光蛋白的生物学活性,可用于蓖麻毒素A链在细胞内的转运途径研究。 展开更多
关键词 蓖麻蛋白 蓖麻毒素A链 发光蛋白质类 重组融合蛋白质类/生物合成 基因表达 大肠杆菌/代谢 聚合酶链反应
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天然蛋白毒素的研究和临床应用展望 被引量:2
8
作者 詹金彪 郑树 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第3期197-200,共4页
 天然蛋白毒素根据其来源可分为植物、细菌和真菌蛋白毒素等家族。其中,植物蛋白毒素包括有双链结构的毒素和单链核糖体失活蛋白,一般具有N-糖苷酶的活性,可催化核糖体28SRNA的保守位点脱嘌呤,从而失活核糖体60S亚基。细菌蛋白毒素具...  天然蛋白毒素根据其来源可分为植物、细菌和真菌蛋白毒素等家族。其中,植物蛋白毒素包括有双链结构的毒素和单链核糖体失活蛋白,一般具有N-糖苷酶的活性,可催化核糖体28SRNA的保守位点脱嘌呤,从而失活核糖体60S亚基。细菌蛋白毒素具有结构的多样性,可以失活延长因子2(EF-2)或激活G蛋白,引起细胞功能障碍。毒素一般通过受体介导的内吞作用进入细胞,逆分泌途径进行运输和转位。天然蛋白毒素具有抗肿瘤和抗病毒作用,有良好的临床应用前景。 展开更多
关键词 毒素类 蛋白类 单链棱糖体失活蛋白
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ELISA方法研究多糖与人干扰素-γ相互作用 被引量:6
9
作者 冯伟云 赵鲁杭 王克夷 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2004年第4期315-319,325,共6页
目的 :建立一种体外研究多糖与干扰素 - γ(Interferon- γ,IFN- γ)相互作用的 EL ISA方法。方法 :在硼氰氢化钠作用下合成肝素 -牛血清白蛋白复合物 (Heparin- BSA Complex,HBC) ,Sepharose4 B凝胶过滤系统分离纯化 HBC,并用 SDS- PAG... 目的 :建立一种体外研究多糖与干扰素 - γ(Interferon- γ,IFN- γ)相互作用的 EL ISA方法。方法 :在硼氰氢化钠作用下合成肝素 -牛血清白蛋白复合物 (Heparin- BSA Complex,HBC) ,Sepharose4 B凝胶过滤系统分离纯化 HBC,并用 SDS- PAGE鉴定。将 HBC(相当于 0 .5 μg蛋白含量 )包被在酶标板上 ,EL ISA方法检测 HBC与 IFN- γ的相互作用 ,并探讨游离肝素、低分子量肝素、硫酸软骨素 A、硫酸软骨素 C和透明质酸 ,以及卡拉胶等多糖对这种结合的影响。结果 :IFN- γ与 HBC的结合呈 IFN- γ剂量依赖性 ,2 ng左右达到饱和。游离肝素和低分子量肝素以及其他多糖均不同程度地抑制了 IFN- γ与 HBC的结合 ,肝素和低分子肝素的 IC50 分别为 2 .4 μg/ ml和 18.6 μg/ml。结论 :IFN- γ与肝素、卡拉胶高亲和力结合 ,而与硫酸软骨素 A、硫酸软骨素 C、透明质酸结合力极弱。EL ISA是一个简单。 展开更多
关键词 多糖类 干扰素Ⅰ型 肝素 药物相互作用 肝素一BSA复合物 干扰素-Γ 酶联免疫吸附测定
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丝瓜籽核糖体失活蛋白luffin-a基因的克隆和表达 被引量:3
10
作者 徐小蓉 詹金彪 夏铮 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第3期207-211,216,共6页
 目的:从丝瓜籽中克隆HIV整合酶抑制剂luffin-a基因,并构建其表达载体。方法:根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,T-A克隆后鉴定核苷酸序列。构建表达载体pET-44a(+)-luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE...  目的:从丝瓜籽中克隆HIV整合酶抑制剂luffin-a基因,并构建其表达载体。方法:根据报道的cDNA序列,用RT-PCR的方法从未成熟的丝瓜籽中克隆luffin-a基因,T-A克隆后鉴定核苷酸序列。构建表达载体pET-44a(+)-luffin-a,转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达。用透析法对包含体复性;SDS-PAGE鉴定luffin-a表达产物,用MTT法分析其生物学活性。结果:克隆的luffin-a基因与国外报道的核苷酸序列同源性为99.73%,其所编码的氨基酸序列完全一致。经SDS-PAGE分析:luffin-a主要存在于包含体中。MTT法测定:复性后蛋白具有与蓖麻毒素A链相似的细胞毒性。结论:本研究成功地构建了luffin-a的表达系统,所表达蛋白经复性后具有生物学活性。 展开更多
关键词 核糖体蛋白质类 核糖体失活蛋白luffin 丝瓜/化学 克隆 分子 基因表达 细胞毒性 HIV整合酶 聚合酶链反应
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溶酶体参与蓖麻毒素A链降解途径的研究
11
作者 陈春 詹金彪 +1 位作者 沈芬平 沈建根 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 2005年第3期212-216,共5页
 目的:研究溶酶体在蓖麻毒素A链(RTA)细胞内转运过程中的作用。方法:用DNA重组技术,将溶酶体的靶向信号肽KFERQ连接在RTA的羧基端;将构建好的重组质粒pKK223.3-RTA和pKK223.3-RTA-KFERQ转化感受态大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达RTA和RTA...  目的:研究溶酶体在蓖麻毒素A链(RTA)细胞内转运过程中的作用。方法:用DNA重组技术,将溶酶体的靶向信号肽KFERQ连接在RTA的羧基端;将构建好的重组质粒pKK223.3-RTA和pKK223.3-RTA-KFERQ转化感受态大肠杆菌JM109,经IPTG诱导表达RTA和RTA-KFERQ蛋白;重组蛋白质用Blue-Sepharose6B亲和柱纯化,以MTT法分别测定纯化后的RTA与RTA-KFERQ蛋白对体外培养的HEPG2(人肝癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、A549(人肺癌细胞)3种细胞的毒性作用。结果:在大肠杆菌中成功表达了RTA和RTA-KFERQ。与RTA相比较,纯化的重组蛋白在体外有相似的蛋白质合成抑制活性,RTA-KFERQ对HEPG2、Hela和A549细胞的毒性分别减少了约49.87%、54.18%、88.68%。结论:RTA不能完全被溶酶体灭活,RTA可能存在溶酶体外的降解途径。 展开更多
关键词 蓖麻蛋白 蓖麻毒素A链 溶酶体 重组 遗传 肿瘤细胞 培养的
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