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固定化基因工程菌的培养和hEGF表达 被引量:3
1
作者 陈新爱 徐志南 +1 位作者 沈文和 岑沛霖 《化工学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2003年第7期1021-1024,共4页
A genetic recombinant hEGF producer E.coli JM101 was immobilized in polyurethane foam matrix and a three-phase fluidized-bed bioreactor was used to produce human epidermal growth factor (hEGF).The results indicated th... A genetic recombinant hEGF producer E.coli JM101 was immobilized in polyurethane foam matrix and a three-phase fluidized-bed bioreactor was used to produce human epidermal growth factor (hEGF).The results indicated that polyurethane foam is an adequate immobilization material. With the addition of polyurethane foam matrix, the free cell density, plasmid stability and hEGF productivity were higher than those without the foam matrix, respectively. The two-stage culture of the immobilized cells was further carried out, in which, the first stage was performed in a three-phase fluidized-bed bioreactor for cell growth and the second stage was performed in bubbling bed for product expression. At a dilution rate of 0.2 h -1 , after continuous cultivation for more than 60 h, the free cell density and product expression were maintained relatively stable. The hEGF productivity was still higher than 140 mg·L -1 and the fraction of plasmid-carrying was more than 27%. The hEGF productivity in two-stage process was higher than the batch process. 展开更多
关键词 聚氨酯泡沫 hEGF重组菌 固定化培养 质粒稳定性
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酵母生物合成S-腺苷-L-蛋氨酸的动力学研究 被引量:1
2
作者 刘惠 林建平 +1 位作者 吴坚平 岑沛霖 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2004年第2期168-173,共6页
研究了酿酒酵母在葡萄糖和L-蛋氨酸存在时生物合成S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)的规律。在高溶氧(DO>40%)条件下,SAM产率及L-蛋氨酸转化率分别达到了82.2 mgg-1和37.4%。将代谢溢流模型推广应用到包括酵母生长和加前体生物转化过程的动力学... 研究了酿酒酵母在葡萄糖和L-蛋氨酸存在时生物合成S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)的规律。在高溶氧(DO>40%)条件下,SAM产率及L-蛋氨酸转化率分别达到了82.2 mgg-1和37.4%。将代谢溢流模型推广应用到包括酵母生长和加前体生物转化过程的动力学研究,结果表明,该模型能较好地描述实验数据。 展开更多
关键词 S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM AdoMet SAM-e) 酿酒酵母 代谢溢流 动力学
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米多霉素衍生物的生物合成及结构鉴定 被引量:1
3
作者 梁立峰 叶丹 +2 位作者 沈文和 岑沛霖 徐志南 《浙江大学学报(工学版)》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第11期1909-1913,共5页
通过在龟裂链轮丝菌(Streptoverticillium rimofaciensZJU 5119)的发酵过程中添加5-氟胞嘧啶,得到了一种新的核苷类化合物A.通过电喷雾质谱及核磁共振氢谱分析主要信号的归属,推测化合物A是米多霉素的衍生物,区别在于嘧啶环上第5位的取... 通过在龟裂链轮丝菌(Streptoverticillium rimofaciensZJU 5119)的发酵过程中添加5-氟胞嘧啶,得到了一种新的核苷类化合物A.通过电喷雾质谱及核磁共振氢谱分析主要信号的归属,推测化合物A是米多霉素的衍生物,区别在于嘧啶环上第5位的取代基是F,而米多霉素则是羟甲基.发酵液中化合物A的产量达到了0.8 g/L.化合物A的最低抑菌质量浓度为0.157 g/L,只有米多霉素的一半. 展开更多
关键词 核苷类抗生素 米多霉素衍生物 5-氟胞嘧啶 结构鉴定 抑菌活性
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重组人粒细胞刺激因子化学稳定性的影响因素探讨 被引量:1
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作者 郭旺明 蔡谨 +2 位作者 黄磊 徐志南 岑沛霖 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2011年第6期997-1002,共6页
重组人粒细胞刺激因子是一种非常重要的重组蛋白质药物,它容易发生蛋白质氧化。采用反相色谱法测定37℃加速试验和4℃长期稳定性试验中该产品的纯度变化,研究其保藏过程中的化学稳定性。考察了添加氧化剂和还原剂对产品的短期和长期稳... 重组人粒细胞刺激因子是一种非常重要的重组蛋白质药物,它容易发生蛋白质氧化。采用反相色谱法测定37℃加速试验和4℃长期稳定性试验中该产品的纯度变化,研究其保藏过程中的化学稳定性。考察了添加氧化剂和还原剂对产品的短期和长期稳定性作用,结果表明所有氧化剂包括过氧化氢和亚硝酸盐都具有较强的浓度效应而还原剂具有较强的pH依赖性。当亚硝酸盐浓度大于0.1 ppm时,具有明显的氧化作用。进一步考察了不同包装材料和过渡态金属离子对化学稳定性的作用。安瓿瓶火焰融封时会导致过渡态金属离子的溶出,结果表明亚铁离子催化活性最强,在0.05 ppm浓度下就具有明显的氧化作用。加入抗氧化剂L-Met能在一定程度上降低长期保藏过程中化学不稳定性,而添加金属螯合剂EDTA二钠能够明显提高该重组蛋白药物的化学稳定性。 展开更多
关键词 重组人粒细胞刺激因子 化学稳定性 蛋白质氧化 过渡态金属离子 金属螯合剂
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拟热带假丝酵母中羰基还原酶的纯化及其酶学性质研究 被引量:9
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作者 解晴 吴坚平 +2 位作者 林立 徐刚 杨立荣 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2009年第1期92-98,共7页
从拟热带假丝酵母Candida pseudotropicalis 104(C104)中,通过离子交换层析和蓝色琼脂糖亲和层析分离得到依赖于辅酶NAD(H)的羰基还原酶,酶的分子量约为37.5kD。催化氧化反应的最适pH为8.5,催化还原反应的最适pH为6.0~6.5,最适反应温... 从拟热带假丝酵母Candida pseudotropicalis 104(C104)中,通过离子交换层析和蓝色琼脂糖亲和层析分离得到依赖于辅酶NAD(H)的羰基还原酶,酶的分子量约为37.5kD。催化氧化反应的最适pH为8.5,催化还原反应的最适pH为6.0~6.5,最适反应温度均为50℃。该酶热稳定性较低,在pH7.0~8.5环境下较稳定,多数重金属离子均能导致酶活力下降。该酶的反应底物广泛,能高选择性催化还原多种氯代苯乙酮衍生物,其中还原苯乙酮、2′-氯-苯乙酮、3′-氯-苯乙酮和4′-氯-苯乙酮可产生对应的S型醇,其对映体过剩值(e.e.)均达到将近100%。底物上取代基团的位阻效应和电荷诱导效应是羰基还原酶还原底物活力大小的重要影响因素。 展开更多
关键词 羰基还原酶 选择性还原 拟热带假丝酵母 分离纯化
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分子模拟指导化学修饰对有机相中脂肪酶的性能强化 被引量:1
6
作者 郭丽 徐刚 +1 位作者 吴坚平 杨立荣 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2015年第10期3725-3730,共6页
脂肪酶是一种应用广泛的重要生物催化剂,它对手性底物具有良好的立体选择性,而且能适应包括疏水有机溶剂在内的多种非天然反应介质。提高脂肪酶在非天然环境中的立体选择性已经成为关于脂肪酶的研究热点。然而已有研究在提高选择性的同... 脂肪酶是一种应用广泛的重要生物催化剂,它对手性底物具有良好的立体选择性,而且能适应包括疏水有机溶剂在内的多种非天然反应介质。提高脂肪酶在非天然环境中的立体选择性已经成为关于脂肪酶的研究热点。然而已有研究在提高选择性的同时,往往伴随催化活力的降低。本文提出一种基于计算机模拟的理性改造方法,能够在不降低脂肪酶活力的情况下大幅提高其在有机介质中的立体选择性。以洋葱假单胞菌脂肪酶(Pseudomonas cepacia lipase,Pc L)在正己烷中催化手性仲醇的转酯化反应为模型,借助分子动力学模拟,预测N-乙酰咪唑(NAI)修饰Pc L的效果。蛋白质谱证实产生主要影响的是位于Pc L活性口袋内的Tyr29残基。进一步通过实验验证,发现经NAI修饰酪氨酸残基(Tyr)后Pc L催化拆分手性仲醇的对映体选择性最高从E=12.6提高到48.1,同时催化活力也有所提高。 展开更多
关键词 化学修饰 模拟 手性仲醇 对映体选择性 脂肪酶
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基于化学修饰法探讨脂肪酶对手性伯醇的识别机理 被引量:1
7
作者 周勤丽 孟枭 +1 位作者 徐刚 杨立荣 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第11期2695-2700,2706,共7页
洋葱假单胞菌脂肪酶(PcL)催化多种手性伯醇酯的不对称水解反应显示其对结构中含有额外的非酯键氧原子的手性伯醇酯的对映体选择性较高,而对不含额外氧原子的选择性差。分别用多种氨基酸残基特异性的修饰剂修饰PcL,结果发现经N-乙酰咪唑(... 洋葱假单胞菌脂肪酶(PcL)催化多种手性伯醇酯的不对称水解反应显示其对结构中含有额外的非酯键氧原子的手性伯醇酯的对映体选择性较高,而对不含额外氧原子的选择性差。分别用多种氨基酸残基特异性的修饰剂修饰PcL,结果发现经N-乙酰咪唑(NAI)修饰酪氨酸残基(Tyr)后PcL对含额外非酯键氧原子的手性伯醇酯对映体选择性显著降低,而对不含额外氧的伯醇酯选择性几乎不受影响。蛋白质谱证实产生主要影响的是位于PcL活性口袋内的Tyr29残基,手性伯醇酯能否与Tyr29形成额外氢键决定了PcL对其选择性。分子动力学模拟表明,Tyr29被修饰的PcL不能与底物形成氢键,因此选择性明显下降。这一发现成功揭示了脂肪酶对手性伯醇对映体选择性的分子识别机理。 展开更多
关键词 化学修饰 手性伯醇 对映体选择性 分子动力学模拟 洋葱假单胞菌脂肪酶
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伴有辅酶再生过程的Saccharomyces cerevisiae B5不对称还原2’-氯-苯乙酮的催化反应动力学 被引量:9
8
作者 欧志敏 金志华 +2 位作者 吴坚平 杨立荣 岑沛霖 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2005年第4期511-517,共7页
对以5%(体积比)乙醇为辅助底物的伴有辅酶再生过程的SaccharomycescerevisiaeB5不对称还原2’-氯-苯乙酮制备手性药物中间体R-2’-氯-1-苯乙醇的生物催化反应建立了描述底物消耗和产物合成的动力学模型。考察了反应过程中辅酶的种类和含... 对以5%(体积比)乙醇为辅助底物的伴有辅酶再生过程的SaccharomycescerevisiaeB5不对称还原2’-氯-苯乙酮制备手性药物中间体R-2’-氯-1-苯乙醇的生物催化反应建立了描述底物消耗和产物合成的动力学模型。考察了反应过程中辅酶的种类和含量,以及底物和产物随时间的变化量。研究表明,参加反应的还原剂是辅酶Ⅰ。当底物初始浓度≤8.09mmol?L?1,可不考虑底物对微生物的毒害作用,反应可看作两个均符合顺序反应机制的氧化还原反应的耦联。通过实验数据对动力学方程式的拟合,得到动力学参数:Vm1=8.0×10?4mol?L?1?h?1,KmB1=9.0×10-4mol?L?1,KiA1=2.0×10-6mol?L?1。动力学模型模拟计算结果与实验值能较好地吻合。 展开更多
关键词 SACCHAROMYCES CEREVISIAE B5 辅酶再生 动力学模型 2’-氯-苯乙酮
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溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其代谢流迁移的影响 被引量:3
9
作者 黄金 谢希贤 +2 位作者 徐庆阳 温廷益 陈宁 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第1期93-98,共6页
为有效降低L-苏氨酸发酵过程中副产物的积累,考察了发酵过程中的溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其多种副产物积累的影响,并深入探讨了振荡行为对L-苏氨酸生物合成代谢网络的代谢流分布的影响。结果表明:采用溶氧强制振荡工艺能够明... 为有效降低L-苏氨酸发酵过程中副产物的积累,考察了发酵过程中的溶氧强制振荡对L-苏氨酸发酵产率及其多种副产物积累的影响,并深入探讨了振荡行为对L-苏氨酸生物合成代谢网络的代谢流分布的影响。结果表明:采用溶氧强制振荡工艺能够明显提高L-苏氨酸的发酵产率和降低多种抑制性产物的合成。与非振荡工艺相比,经过36h培养,细胞生物量达到29.5g·L-1,苏氨酸的质量浓度达到118.9g·L-1,而乙酸质量浓度下降到0.8g·L-1,副产的其他氨基酸也大大降低。通过代谢流分析表明,在发酵后期的一个振荡周期(30h至31h)内,与非振荡组相比,HMP途径的代谢流量由6.5提高至95.88,CO2固定反应代谢流量由45.1提高至86.1,TCA循环相对代谢流量从1.86提高至17.78,从而导致苏氨酸对葡萄糖的质量转化率从30.0%增加至57.0%。溶氧强制振荡条件下的苏氨酸发酵液中各种副产物更少,更适合今后的大规模工业化生产。 展开更多
关键词 L-苏氨酸 强制振荡 乙酸 溶氧:代谢流分布
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蛋白质在膨胀床吸附层析剂的静态和动态吸附性能 被引量:2
10
作者 胡洪波 姚善泾 朱自强 《化学工程》 EI CAS CSCD 北大核心 2001年第1期37-40,共4页
以牛血清白蛋白 (BSA)为目标蛋白 ,考察膨胀床用离子交换树脂StreamlineDEAE的静态和动态吸附性能 ,并和离子交换树脂DEAESepharoseFF进行比较 ,实验发现两者的静态吸附性能相似 ,而动态吸附性能差别较大。根据动态吸附数据计算出液膜... 以牛血清白蛋白 (BSA)为目标蛋白 ,考察膨胀床用离子交换树脂StreamlineDEAE的静态和动态吸附性能 ,并和离子交换树脂DEAESepharoseFF进行比较 ,实验发现两者的静态吸附性能相似 ,而动态吸附性能差别较大。根据动态吸附数据计算出液膜扩散系数和孔内扩散系数。 展开更多
关键词 蛋白质 膨胀床 吸附层析剂 离子交换 扩散系数 牛血清白蛋白 静态 动态 吸附性能
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酰基供体对动态动力学拆分1-四氢萘胺的影响 被引量:1
11
作者 戴晓庭 孟枭 +2 位作者 徐刚 吴坚平 杨立荣 《化工进展》 EI CAS CSCD 北大核心 2014年第9期2421-2424,共4页
采用新型消旋催化剂耦合Novozym 435成功构建1-四氢萘胺的动态动力学拆分体系用于制备光学纯(R)-1-四氢萘胺。该反应存在着自催化酰胺化反应,会降低反应的对映体选择性。从改变酰基供体结构的角度出发来抑制这种自催化酰胺化反应,考察... 采用新型消旋催化剂耦合Novozym 435成功构建1-四氢萘胺的动态动力学拆分体系用于制备光学纯(R)-1-四氢萘胺。该反应存在着自催化酰胺化反应,会降低反应的对映体选择性。从改变酰基供体结构的角度出发来抑制这种自催化酰胺化反应,考察了不同酸部以及不同醇部的酰基供体对1-四氢萘胺动态动力学拆分反应的影响,发现随着酰基供体结构变得复杂,1-四氢萘胺动态动力学拆分反应结果也相应变得越好,当采用戊酸对氯苯酯作为酰基供体时,动态动力学拆分反应结果就可达到最佳,即转化率>99%,光学纯度eeP>99%。 展开更多
关键词 动态动力学拆分 Novozym 435 1-四氢萘胺 酰基供体
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羧酸酯酶BioH的克隆表达及其水解活性的定向进化
12
作者 徐红娜 于洪巍 《浙江大学学报(农业与生命科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期607-612,共6页
通过分子克隆手段获得大肠杆菌来源的羧酸酯酶BioH,采用定向进化的方法提高该酶的水解活性以提升其应用价值.通过PCR扩增,从大肠杆菌K12菌株中克隆得到羧酸酯酶BioH基因,目的基因长度为771bp,含256个氨基酸;将其连接到pET30a(+... 通过分子克隆手段获得大肠杆菌来源的羧酸酯酶BioH,采用定向进化的方法提高该酶的水解活性以提升其应用价值.通过PCR扩增,从大肠杆菌K12菌株中克隆得到羧酸酯酶BioH基因,目的基因长度为771bp,含256个氨基酸;将其连接到pET30a(+)质粒上并转入BL21(DE3)宿主细胞中,经诱导表达得到所需的目的蛋白,该蛋白分子质量约为28.2ku.野生型的BioH水解对硝基苯丁酸酯(P—NPB)的活性为18U/mg,且该酶具有良好的热稳定性.以PNPB为底物进行高通量筛选,其水解底物为对硝基苯酚(PNP),在405nm处有最大吸收峰.挑选出水解活性提高的突变体,并通过2轮定向进化过程,成功筛选到7个水解活性提高的优良突变体,它们的活性分别提高了20%~100%.结构分析表明,突变体的突变位点均分布在远离活性中心的位置. 展开更多
关键词 羧酸酯酶BioH 克隆 表达 定向进化 水解活性
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