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青蒿素与牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的分子对接预测及其抗病毒作用
被引量：
7
1
作者
邵百卉
姜东君
+5 位作者
谢艺萌
刘思雨
邵子益
张泽财
计红
朱战波
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2022年第9期3581-3588,共8页
【目的】采用分子对接以及体外试验确定青蒿素对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的抑制作用,为抗病毒药物和制剂开发提供新思路。【方法】以BVDV-NS5B蛋白为作用靶点,通过PDB数据库检索蛋白三维晶体结构,并对...
【目的】采用分子对接以及体外试验确定青蒿素对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的抑制作用,为抗病毒药物和制剂开发提供新思路。【方法】以BVDV-NS5B蛋白为作用靶点,通过PDB数据库检索蛋白三维晶体结构,并对其结构进行适当修饰处理;检索TCMSP数据库中的青蒿素结构,应用Autodock软件将两者进行分子对接及结合能打分。随后采用CCK-8试剂盒测定青蒿素对MDBK细胞的最大安全浓度;将选定浓度的青蒿素进行梯度稀释,采用先加病毒后加药物、先加药物后加病毒、中药和病毒同时作用的3种不同加药方式进行药物抗病毒试验,确定对病毒的最佳药物抑制浓度、预防浓度和杀灭浓度。应用实时荧光定量PCR法检测3种药物作用方式下BVDV的拷贝数,进一步明确药物对BVDV复制的作用。【结果】分子对接数据表明青蒿素与BVDV-NS5B存在相互作用,结合自由能为-28.6748 kJ/mol。青蒿素在MDBK细胞上的最佳药物安全浓度为100μmol/L。3种作用方式下青蒿素浓度为100μmol/L时均可有效影响BVDV的复制,青蒿素对BVDV的抑制作用最为明显。【结论】青蒿素可与BVDV-NS5B蛋白靶点互作,并能在MDBK细胞上有效抑制BVDV的复制,本研究为抗BVDV中药筛选奠定了基础。
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关键词
青蒿素
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)
抗病毒活性
分子对接
病毒复制
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职称材料
重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化
被引量：
3
2
作者
焦凤娟
刘俊杰
+1 位作者
卢思维
姜东君
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第5期1109-1115,共7页
目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n...
目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果:第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。结论:利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。
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关键词
转录因子EB
重叠延伸PCR
定点突变
融合蛋白
丝氨酸
丙氨酸
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职称材料
题名
青蒿素与牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的分子对接预测及其抗病毒作用
被引量：
7
1
作者
邵百卉
姜东君
谢艺萌
刘思雨
邵子益
张泽财
计红
朱战波
机构
黑龙江八一农垦大学动物科技
学院
黑龙江省牛病防控工程技术研究中心
济宁
医学院
精神
卫生
学院
出处
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2022年第9期3581-3588,共8页
基金
国家自然科学基金(32072896)。
文摘
【目的】采用分子对接以及体外试验确定青蒿素对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的抑制作用,为抗病毒药物和制剂开发提供新思路。【方法】以BVDV-NS5B蛋白为作用靶点,通过PDB数据库检索蛋白三维晶体结构,并对其结构进行适当修饰处理;检索TCMSP数据库中的青蒿素结构,应用Autodock软件将两者进行分子对接及结合能打分。随后采用CCK-8试剂盒测定青蒿素对MDBK细胞的最大安全浓度;将选定浓度的青蒿素进行梯度稀释,采用先加病毒后加药物、先加药物后加病毒、中药和病毒同时作用的3种不同加药方式进行药物抗病毒试验,确定对病毒的最佳药物抑制浓度、预防浓度和杀灭浓度。应用实时荧光定量PCR法检测3种药物作用方式下BVDV的拷贝数,进一步明确药物对BVDV复制的作用。【结果】分子对接数据表明青蒿素与BVDV-NS5B存在相互作用,结合自由能为-28.6748 kJ/mol。青蒿素在MDBK细胞上的最佳药物安全浓度为100μmol/L。3种作用方式下青蒿素浓度为100μmol/L时均可有效影响BVDV的复制,青蒿素对BVDV的抑制作用最为明显。【结论】青蒿素可与BVDV-NS5B蛋白靶点互作,并能在MDBK细胞上有效抑制BVDV的复制,本研究为抗BVDV中药筛选奠定了基础。
关键词
青蒿素
牛病毒性腹泻病毒(BVDV)
抗病毒活性
分子对接
病毒复制
Keywords
artemisinin
Bovine viral diarrhea virus(BVDV)
antiviral activity
molecular docking
virus replication
分类号
S859.3 [农业科学—临床兽医学]
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职称材料
题名
重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化
被引量：
3
2
作者
焦凤娟
刘俊杰
卢思维
姜东君
机构
济宁医学院精神卫生学院山东省行为医学重点实验室
出处
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第5期1109-1115,共7页
基金
国家自然科学基金青年基金项目(82101340)。
文摘
目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果:第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。结论:利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达。
关键词
转录因子EB
重叠延伸PCR
定点突变
融合蛋白
丝氨酸
丙氨酸
Keywords
Transcription factor EB
Gene splicing by overlap extension PCR
Site-directed mutagenesis
Fusion protein
Serine
Alanine
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
青蒿素与牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的分子对接预测及其抗病毒作用
邵百卉
姜东君
谢艺萌
刘思雨
邵子益
张泽财
计红
朱战波
《中国畜牧兽医》
CAS
北大核心
2022
7
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化
焦凤娟
刘俊杰
卢思维
姜东君
《吉林大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2022
3
在线阅读
下载PDF
职称材料
已选择
0
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参考文献
引证文献
统计分析
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