mRNA疫苗-分子设计、递呈及免疫活化的分子机制

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作者 陈慧敏 刘飞飞 +2 位作者 尚珂 张春杰 陈松彪 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第2期186-192,共7页

疫苗免疫是防控传染病最有效且性价比最优的途径。2019年末新型冠状病毒肺炎(COVID-19,简称新冠)爆发以来,第三代颠覆性创新-mRNA核酸疫苗在阻击新冠道路上大放异彩。mRNA疫苗突破了传统疫苗的免疫激活模式,创新性地利用人体自身细胞生... 疫苗免疫是防控传染病最有效且性价比最优的途径。2019年末新型冠状病毒肺炎(COVID-19,简称新冠)爆发以来,第三代颠覆性创新-mRNA核酸疫苗在阻击新冠道路上大放异彩。mRNA疫苗突破了传统疫苗的免疫激活模式,创新性地利用人体自身细胞生产抗原,以此激活双重特异性免疫,形成免疫记忆,提供更持久的特异性免疫。相较于传统第一代(灭活疫苗)和第二代疫苗(基因工程疫苗),mRNA疫苗借助其平台化优势,在重大突发性传染病防控中发挥重要作用,成为全球首个进入临床的新冠疫苗,是疫苗研发领域风向标。本文主要针对mRNA疫苗分子设计、递呈以及其激活机体免疫应答的分子机制进行综述,旨在为后续新型mRNA疫苗在动物传染病防控中的应用提供理论依据。 展开更多

关键词 mRNA疫苗 分子设计 递呈 免疫活化 动物传染病

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Beclin-1基因shRNA慢病毒载体的构建及其对B16F10细胞自噬及活力的影响 被引量：3

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作者 贾艳艳 赵莹莹 +6 位作者 余祖华 何雷 廖成水 李静 郁川 张春杰 李银聚 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期2609-2616,共8页

利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感... 利用RNA干扰技术构建稳定沉默Beclin-l基因的B16F10小鼠黑色素瘤细胞系,分析稳转细胞系的自噬水平和活力,为探讨Beclin-1基因、自噬与肿瘤三者关系奠定基础。构建小鼠Beclin-l基因干扰载体,转染至293T细胞,获得慢病毒颗粒,将病毒颗粒感染B16F10细胞,通过加压筛选、有限稀释、细胞驯化得到稳定转染m-Beclin-1-shRNA1的B16F10细胞系。采用RT-PCR和免疫荧光技术检测对Beclin-l的干扰效果,Western blot和透射电镜分析稳转细胞系中自噬标志物LC3蛋白表达及自噬小体形成情况,CCK-8法检测稳转细胞系的活力。结果表明,成功构建了靶向抑制Beclin-l基因表达的shRNA,纯化的慢病毒滴度为1×10^(8) TU·mL^(-1),建立的细胞系中Beclin-1 mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,mRNA的沉默效率约为75%(P<0.01),发现干预Beclin-1表达能够抑制LC3-Ⅱ蛋白的表达及自噬小体的形成数量,降低B16F10细胞活力。以上结果表明,干扰Beclin-1表达能够有效降低B16F10细胞自噬活性,促进B16F10细胞死亡,这为探讨Beclin-1基因功能及自噬在抗肿瘤中的作用奠定重要基础。 展开更多

关键词 RNA干扰 B16F10细胞 Beclin-1基因 慢病毒载体 细胞自噬

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减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔsseK1Δasd宿主-载体平衡致死系统的构建及其生物学特性研究 被引量：2

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作者 杨亚东 丁轲 +3 位作者 张春杰 程相朝 贾艳艳 何雷 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第10期1521-1526,共6页

目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选... 目的:为构建减毒鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株平衡致死系统,并将其开发为能够稳定携带外源基因的活疫苗载体。方法:利用重组自杀性质粒(pREΔasd)介导的等位基因交换技术,以减毒鼠伤寒沙门菌株SL1344Δsse K1为亲本株,运用二步法筛选asd基因缺失株SL1344Δsse K1Δasd。将携带有asd基因的无抗性p YA3493质粒电转至上述缺失菌株SL1344Δsse K1Δasd,构建SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)重组菌株。结果:PCR及测序结果表明SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)构建成功。进一步研究表明重组菌株SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)血清型和强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相同,且能稳定遗传缺失后的asd基因;其生化特性和生长速度与强毒株SL1344及亲本株SL1344Δsse K1相比均无明显差异。小鼠毒力试验表明,SL1344Δsse K1Δasd(p YA3493)口服感染6周龄BALB/c小鼠的LD50为5.24×108CFU,毒力较强毒株SL1344约下降至0.048%;免疫保护效力试验显示,运用鼠伤寒沙门菌野生毒株对免疫后第17天的小鼠攻毒有62.5%的保护率,与亲本株SL1344Δsse K1基本一致。结论:以上结果表明,鼠伤寒沙门菌分泌性蛋白K1缺失株宿主-载体平衡致死系统构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,具有较好的免疫原性,为深入研究以鼠伤寒沙门菌为载体的口服多价疫苗奠定基础。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 自杀性质粒 宿主-载体平衡致死系统 活疫苗载体

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溶血性曼氏杆菌OmpA的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

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作者 尚珂 高远集 +9 位作者 刘畅 代静蕾 丁梦豪 聂孟川 王怡轩 陈松彪 贾艳艳 郭荣显 丁轲 余祖华 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期376-383,共8页

为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司... 为建立一种快速、高效、准确的溶血性曼氏杆菌(MH)抗体的检测方法,本研究采用生物信息学软件对MH外膜蛋白A(OmpA)的理化性质和亲/疏水性、跨膜结构和信号肽进行分析后,利用PCR扩增MH OmpA基因,构建重组表达质粒pET-32a-OmpA,经生物公司测序及酶切鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,经IPTG诱导重组OmpA蛋白(r OmpA)的表达,SDS-PAGE检测结果显示,在约57 ku处出现目的条带,且rOmpA主要以为包涵体形式表达。rOmpA表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定,结果显示,在57.03 ku处出现特异性条带,表明r OmpA可与MH阳性血清产生良好的反应原性。以rOmpA作为包被抗原,采用方阵法通过对各反应条件的优化,初步建立MH抗体的间接ELISA检测方法。利用该方法检测多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌、MH-1、MH CVCC4091(A5型)以及MH-2(A1型)阳性血清,结果显示,除MH-1、CVCC4091以及MH-2检测为阳性外,其他细菌阳性血清均为阴性结果,特异性较强。利用该间接ELISA方法检测2倍倍比稀释的待检阳性血清(1:8000~1:512000),结果显示,阳性血清稀释至1:512000时仍为阳性,敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的r OmpA包被ELISA板,按照该ELISA方法检测5份MH阳性血清,分析该方法的重复性。结果显示,批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明该方法重复性好。采用建立的间接ELISA方法和间接血凝试验(IHA),对82份临床动物(羊、兔、鼠)血清样品检测,结果显示,间接ELISA检测方法的阳性率为47.6%,阴性率为52.4%;IHA检测方法的阳性率为45.1%,阴性率为54.9%。二者的阳性符合率为94.9%,阴性符合率为95.6%,总符合率为99.3%。另外,从鼠体内检出MH阳性率最高为75.0%,表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。该检测方法的建立为临床MH抗体的检测提供可靠的技术手段,为MH的流行病学调查等奠定了基础。 展开更多

关键词 溶血性曼氏杆菌5型 外膜蛋白A 原核表达 小鼠 间接ELISA

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牛病毒性腹泻病毒1型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立与应用

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作者 刘飞飞 杨澳飞 +7 位作者 贾东鹭 韩新雨 陈慧敏 陈建 魏颖 丁轲 张春杰 陈松彪 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第4期363-369,共7页

为建立牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参考GenBank中的不同BVDV-1序列,设计并合成Npro基因保守区域特异性引物,以重组质粒标准品作为模板对反应体系进行优化,初步建立一种BVDV-1特异性SYBR GreenⅠ... 为建立牛病毒性腹泻病毒1型(BVDV-1)荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测方法,本研究参考GenBank中的不同BVDV-1序列,设计并合成Npro基因保守区域特异性引物,以重组质粒标准品作为模板对反应体系进行优化,初步建立一种BVDV-1特异性SYBR GreenⅠRT-qPCR方法,结果显示,RT-qPCR方法的最适退火温度为55℃,最佳引物终浓度为0.4μmol/L;质粒标准品浓度在5.46×10^(1)拷贝/μL~5.46×10^(7)拷贝/μL之间与各自的Ct值具有良好的线性关系,线性方程为:y=-3.2011x+33.6,R^(2)=0.9975,熔解曲线为单一峰值;以BVDV-1、牛病毒性腹泻病毒2型、牛病毒性腹泻病毒3型、边界病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒等的RNA反转录所得cDNA以及大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌总DNA为模板,采用本研究建立的RT-qPCR方法检测,评估该方法的特异性;分别以10倍倍比稀释(10^(1)~10^(9))的pMD19-T-Npro重组质粒标准品作为模板,利用本研究建立的方法与普通RT-PCR方法检测,比较所建方法的敏感性;以5个不同浓度的重组质粒标准品pMD19-T-Npro作为模板,利用RT-qPCR方法分别于同一时间和不同时间分别进行批内和批间重复性试验,评估该方法的重复性。特异性试验结果显示,该方法仅对BVDV-1有特异性扩增曲线,牛病毒性腹泻病毒2型、牛病毒性腹泻病毒3型、边界病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的检测限为5.46×10^(1)拷贝/μL,敏感性高;对重组质粒标准品的批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。采用本研究建立的RT-qPCR方法和文献中的BVDV-1 RT-qPCR方法分别对50份腹泻牛粪便样品检测,结果显示,两种方法的阳性检出率均为16%(8/50),总符合率达100%。本研究建立的RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为BVDV临床快速检测、流行病学调查及疫病防控工作提供了新的技术支撑和思路。 展开更多

关键词 牛病毒性腹泻病毒1型 Npro基因 荧光定量RT-PCR 应用

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基于全基因组测序的枯草芽孢杆菌ZJ20体外安全性评价

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作者 郭晶 黄美雪 +4 位作者 郭霖丰 冯婉丽 贾艳艳 廖成水 余祖华 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3987-3998,共12页

[目的]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis) ZJ20是一株具有降解黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))的菌株。试验旨在评价枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌ZJ20的体外安全性,以期为该菌株在降解饲料和食品中AFB_(1)的应用提供... [目的]枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis) ZJ20是一株具有降解黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))的菌株。试验旨在评价枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌ZJ20的体外安全性,以期为该菌株在降解饲料和食品中AFB_(1)的应用提供依据。[方法]对枯草芽孢杆菌ZJ20的全基因组序列中的毒力基因、耐药基因以及生物被膜形成相关基因等进行预测,根据基因分析结果对药物敏感性及生物被膜形成能力进行验证,并对枯草芽孢杆菌ZJ20的表面疏水性、自聚力、共聚力进行检测。以鸡肝癌细胞(leghorn male hepatoma,LMH)为模型,将枯草芽孢杆菌ZJ20无细胞上清液(CFS)按照不同剂量作用于LMH细胞,检测其对LMH细胞活力、凋亡因子(Caspase-3、Caspase-9、BAX、Bcl-2)和炎症相关细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ)表达水平的影响,以评价枯草芽孢杆菌ZJ20的潜在细胞毒性。[结果]枯草芽孢杆菌ZJ20基因组中被注释的毒力因子编码基因有26个,多与免疫逃避、防御作用相关,无肠毒素编码基因;具有11个抗生素耐药基因,药敏试验结果显示,枯草芽孢杆菌ZJ20对多种抗生素均敏感;预测到14个生物被膜调控基因,菌株在24 h时生物被膜形成能力达到最高值;表面疏水率为47.842%,自聚率为59.334%;与鼠伤寒沙门菌ATCC 14028的共聚率为60.905%,与大肠杆菌CVCC 1527的共聚率为47.309%。细胞活力检测结果表明,枯草芽孢杆菌ZJ20 CFS添加量为1%且与LMH细胞作用36 h时,细胞活力上升至107.34%。凋亡和炎症相关的细胞因子测定结果显示,随着剂量的增加,与对照组相比,Caspase-3表达显著上调(P<0.05),Caspase-9、BAX/Bcl-2比值无显著变化(P>0.05);IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ表达均显著下调(P<0.05)。[结论]通过全基因组序列分析及其对LMH细胞活力、凋亡因子和炎症相关细胞因子表达水平影响的检测表明枯草芽孢杆菌ZJ20具有一定的安全性,为其开发为功能性益生菌的应用安全性提供了参考。 展开更多

关键词 全基因组测序 枯草芽孢杆菌 安全性 耐药 毒力

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gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响 被引量：3

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作者 余祖华 丁轲 +11 位作者 郁川 贾艳艳 何雷 廖成水 李静 张春杰 李银聚 吴庭才 程相朝 张梦珂 邱静静 罗俊 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第11期2496-2504,共9页

为了解gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响,将人工合成的gga-miR-155模拟物、gga-miR-155抑制物以及阴性对照瞬时转染MDCC-MSB1细胞。然后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MDCC-MSB1细胞中gga-miR-155的表达水平,CCK-8法检测... 为了解gga-miR-155对MDCC-MSB1细胞生物学行为的影响,将人工合成的gga-miR-155模拟物、gga-miR-155抑制物以及阴性对照瞬时转染MDCC-MSB1细胞。然后采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测MDCC-MSB1细胞中gga-miR-155的表达水平,CCK-8法检测转染后细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测MDCC-MSB1细胞的细胞周期与凋亡的变化,Transwell检测MDCC-MSB1细胞的迁移、侵袭能力的变化。结果显示,gga-miR-155模拟物可显著上调MDCC-MSB1细胞gga-miR-155表达水平,促进MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞减少,S和G2期细胞增加,同时凋亡减少,迁移、侵袭能力增加;gga-miR-155抑制物可显著下调MDCCMSB1细胞gga-miR-155表达水平,抑制MDCC-MSB1细胞增殖,细胞G1期细胞增加、S和G2期细胞减少,同时凋亡增加,迁移、侵袭能力下降。结果表明,gga-miR-155可促进MDCC-MSB1细胞增殖、迁移和侵袭,抑制其凋亡。 展开更多

关键词 gga-miR-155 MDCC-MSB1细胞 细胞增殖 细胞凋亡 迁移 侵袭

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表达NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌的构建及其生物学特性分析 被引量：1

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作者 贾艳艳 刘莎莎 +9 位作者 丁轲 何雷 余祖华 李静 郁川 廖成水 程相朝 李银聚 殷月兰 张春杰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期567-572,共6页

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组... 为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN和传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2融合蛋白的重组减毒沙门菌,并分析其生物学特性。本研究扩增了NDVHN和IBDVVP2主要抗原基因片段,通过重叠延伸PCR扩增获得HN-VP2融合基因,构建重组质粒pYA-HN-VP2,将该重组质粒电转化至减毒鼠伤寒沙门菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd中,获得表达HN-VP2融合蛋白的减毒重组菌SL1344ΔcrpΔcyaΔasd(pYA-HN-VP2),并分析其生化特性、遗传稳定性和毒力等生物学特性。Westernblot结果显示,重组减毒沙门菌可分泌表达HN-VP2融合蛋白,大小为84ku,且该融合蛋白分别能与相应特异性阳性血清发生反应;生物学特性结果显示,重组菌株失去了利用麦芽糖、山梨醇及乳糖等碳源的能力,其生长速度显著慢于野生菌株SL1344;毒力较野生菌株至少下降5个对数单位,且能够稳定遗传重组质粒pYA-HN-VP2。本研究为鸡新城疫-传染性法氏囊病-沙门菌病的三联口服疫苗研制奠定重要基础。 展开更多

关键词 减毒沙门菌 传染性法氏囊病 新城疫 构建 生物学特性

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貂源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及胞外分泌蛋白的核酸酶活性分析 被引量：1

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作者 贾艳艳 李琦 +5 位作者 王晓利 牛俊辉 毛静 廖成水 张昊恺 张明亮 《河南农业科学》 北大核心 2021年第3期142-147,共6页

为确定引起水貂肺炎的病原菌,对从临床死亡病例中分离到的1株疑似肺炎克雷伯菌进行鉴定,采用琼脂糖凝胶电泳法检测肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,并探究了温度、pH值、金属离子对核酸酶活性的影响。结果显示,通过病料涂片镜检及... 为确定引起水貂肺炎的病原菌,对从临床死亡病例中分离到的1株疑似肺炎克雷伯菌进行鉴定,采用琼脂糖凝胶电泳法检测肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,并探究了温度、pH值、金属离子对核酸酶活性的影响。结果显示,通过病料涂片镜检及PCR鉴定,分离株为1株肺炎克雷伯菌,该肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白表现出降解λDNA的核酸酶活性,最适温度为30~37℃,最适pH值为7.0,在高温和碱性条件的反应环境时核酸酶的活性较弱。一价金属离子(Na^(+)、K^(+))和部分二价金属离子(Ca^(2+)、Ba^(2+)、Ni^(2+)、Zn^(2+)和Cu^(2+))对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性无明显影响,而5.00~10.00 mmol/L的Co^(2+)和Fe^(3+)以及10.00 mmol/L的Mg^(2+)和Mn^(2+)可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性。综上,从临床水貂肺炎病例中分离到1株肺炎克雷伯菌,并证实该菌胞外分泌蛋白具有核酸酶活性。 展开更多

关键词 水貂 肺炎克雷伯菌 分离鉴定 胞外分泌蛋白 核酸酶

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巨噬细胞极化在微生物感染中的作用研究进展 被引量：1

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作者 廖成水 毛福超 程相朝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期323-327,共5页

巨噬细胞(Macrophage)起源于骨髓中的前体细胞,分化成熟的巨噬细胞广泛分布于机体各个组织和器官中[1]。在特定因素作用下,机体内某些细胞可以直接分化成为巨噬细胞,不同细胞分化后的巨噬细胞可以分布于不同组织[2]。巨噬细胞是参与机... 巨噬细胞(Macrophage)起源于骨髓中的前体细胞,分化成熟的巨噬细胞广泛分布于机体各个组织和器官中[1]。在特定因素作用下,机体内某些细胞可以直接分化成为巨噬细胞,不同细胞分化后的巨噬细胞可以分布于不同组织[2]。巨噬细胞是参与机体固有免疫的一类重要免疫细胞,不但可以吞噬外来微生物,还能递呈抗原,通过合成分泌多种细胞因子发挥功效,在控制炎症变化的过程中起到主导作用。当外界病原体侵入机体引发感染时,机体的无菌环境被打破,巨噬细胞被激活后识别病原体和抗原递呈,吞噬杀灭病原体起到免疫保护作用。 展开更多

关键词 肝巨噬细胞 炎症反应 巨噬细胞极化 戈登氏链球菌 寄生虫感染 微生物感染

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鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征及其蛋白核酸酶活性分析

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作者 张梦珂 廖成水 +5 位作者 毛福超 王晓利 李银聚 吴庭才 张春杰 程相朝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期675-679,共5页

为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征,本研究应用PCR扩增得到鼠伤寒沙门菌SL1344株的5'-nucleotidase基因片段,利用在线网站和DNAMAN 6.0.3.48软件进行其核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。然后将目的基因亚克隆至... 为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征,本研究应用PCR扩增得到鼠伤寒沙门菌SL1344株的5'-nucleotidase基因片段,利用在线网站和DNAMAN 6.0.3.48软件进行其核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。然后将目的基因亚克隆至原核表达载体p ET32a构建重组表达质粒(pET32a-5'-nucleotidase),转入大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导表达,亲和层析法纯化后采用SDS-PAGE和western blot进行分析。采用酶切活性试验分析重组蛋白的核酸酶活性。结果显示,鼠伤寒沙门菌SL1344株5'-nucleotidase基因为1 482 bp,5'-nucleotidase核苷酸序列与其它22种微生物的5'-nucleotidase及其类似物的同源性较低,最高仅为52.8%。理论上蛋白的分子量为57.18 ku,编码523个氨基酸。SDS-PAGE和western blot结果显示5'-nucleotidase重组蛋白约72 ku,且以可溶性和包涵体两种形式表达。同时,酶切活性试验结果显示重组5'-nucleotidase蛋白具有降解DNA的能力。本实验克隆了鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因,并表达得到了具有核酸酶活性的重组蛋白,为进一步研究5'-nucleotidase基因在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 5'-nucleotidase基因 克隆 序列分析 原核表达

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降解纤维素凝结芽孢杆菌的分离鉴定及生物学特性研究 被引量：4

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作者 余祖玲 余祖华 +5 位作者 贾艳艳 廖成水 李旺 李元晓 何万领 丁轲 《河南科技大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2022年第5期84-91,99,M0007,M0008,共11页

为筛选降解纤维素性能优良的芽孢杆菌,探究其生物学特性,采集不同地方的土壤作为样品,将其接种到羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基进行分离。观察菌株是否产生水解圈进行初筛,再通过检测滤纸酶活和纤维素酶活进行复筛。通过形态学观察、生... 为筛选降解纤维素性能优良的芽孢杆菌,探究其生物学特性,采集不同地方的土壤作为样品,将其接种到羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基进行分离。观察菌株是否产生水解圈进行初筛,再通过检测滤纸酶活和纤维素酶活进行复筛。通过形态学观察、生理生化及16S rDNA测序对菌株进行鉴定,并对分离菌株进行胆盐、酸、人工胃液、高温的耐受能力测试及药敏试验。筛选获得了1株降解纤维素功能较强的菌株MRS-913,经鉴定为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。生物学性能试验表明:该菌株在100℃水浴中15 min存活率达54.0%;在质量分数为4%的胆盐中4 h存活率为32.8%;在pH1.0的酸液中4 h存活率为55.9%;在pH1.5和pH2.5的模拟胃液中3 h存活率分别为62.7%和74.8%。药敏试验结果表明:该菌株对青霉素、氟苯尼考和头孢曲松高度敏感,对杆菌肽、奥普托欣和林可霉素不敏感。因此,凝结芽孢杆菌MRS-913有望成为微生态制剂的候选菌株。 展开更多

关键词 纤维素 凝结芽孢杆菌 分离鉴定 生物学特性

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一株毕赤酵母菌MC-1降解呕吐毒素、生物学特性及初步应用 被引量：5

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作者 邵春山 余祖华 +9 位作者 廖成水 贾艳艳 李静 魏颖 李元晓 曹平华 何万领 赵龙妹 李旺 丁轲 《中国饲料》 北大核心 2023年第3期37-43,共7页

呕吐毒素(DON)是危害动物健康的霉菌毒素之一,本研究旨在分离出能够降解DON的益生菌,以期应用于动物饲料中降解DON。本研究从普洱茶叶中分离出一株益生菌,经16S rDNA基因序列比对确定该菌株为毕赤酵母菌MC-1菌株;其在含有DON(1 mg/L)发... 呕吐毒素(DON)是危害动物健康的霉菌毒素之一,本研究旨在分离出能够降解DON的益生菌,以期应用于动物饲料中降解DON。本研究从普洱茶叶中分离出一株益生菌,经16S rDNA基因序列比对确定该菌株为毕赤酵母菌MC-1菌株;其在含有DON(1 mg/L)发酵液中DON降解率为59.21%。此外研究了毕赤酵母菌MC-1生物学特性,活性成分定位和应用试验。结果表明:毕赤酵母菌MC-1具有耐盐、耐酸、耐胆盐及在模拟消化液中存活的特性;其发酵上清液(DON 1 mg/L) DON降解率为54.76%,该菌株与(DON 1 mg/kg)豆粕共同发酵48 h后DON降解率为46.79%。综上,毕赤酵母菌MC-1能够用于动物发酵饲料中降解DON。 展开更多

关键词 毕赤酵母菌 呕吐毒素 降解菌 发酵饲料

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禽多杀性巴氏杆菌C48-1株胞外分泌蛋白的DNase活性分析 被引量：3

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作者 陈耀华 董何凡 +8 位作者 李琦 牛俊辉 钱满 王晓利 全映颖 刘桂坤 雷显前 程相朝 廖成水 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期984-989,共6页

为探究多杀性巴氏杆菌(Pm)胞外分泌蛋白的DNase活性及对该蛋白DNase活性影响的因素,本研究经琼脂培养法以λDNA为底物鉴定禽Pm C48-1株胞外蛋白的DNase活性,将Pm培养5 h后采用低温透析法收集禽Pm C48-1株的胞外分泌蛋白,并采用BCA试剂... 为探究多杀性巴氏杆菌(Pm)胞外分泌蛋白的DNase活性及对该蛋白DNase活性影响的因素,本研究经琼脂培养法以λDNA为底物鉴定禽Pm C48-1株胞外蛋白的DNase活性,将Pm培养5 h后采用低温透析法收集禽Pm C48-1株的胞外分泌蛋白,并采用BCA试剂盒测定其浓度,进一步利用Kunitz法检测Pm胞外分泌蛋白的DNase活性。结果显示,禽Pm分泌的胞外蛋白能够降解λDNA,即其有DNase活性,且获得的胞外分泌蛋白的浓度为1.32μg/mL,其降解λDNA的活性水平为6.07×10^(6) Kunitz Unit/mg。利用琼脂糖凝胶电泳法检测胞外分泌蛋白降解不同底物DNA的能力以及酸碱、温度和不同浓度金属阳离子对胞外分泌蛋白降解λDNA活性的影响。结果显示,Pm胞外分泌蛋白的DNase活性具有广谱性,可降解λDNA、细菌基因组DNA、质粒DNA和PCR扩增的DNA片段。DNase活性影响因素的检测结果显示,Pm胞外分泌蛋白降解λDNA的最适温度为30℃,在pH7.0~pH9.0时该蛋白的DNase活性较好,而在酸性和强碱性时该蛋白则无DNase活性。不同浓度的Na^(+)、K^(+)和Ba^(2+)对胞外分泌蛋白的DNase活性均无明显影响;不同浓度的Ca^(2+)、Mg^(2+)和Mn^(2+)可提高胞外分泌蛋白的DNase活性;1 mmol/L和5 mmol/L的Co^(2+)以及0.01 mmol/L和0.1 mmol/L的Cu^(2+)则可抑制该蛋白的DNase活性,而1 mmol/L和5 mmol/L的Cu^(2+)则对该蛋白的DNase活性无明显影响。本研究首次证实了禽Pm C48-1株胞外分泌蛋白的DNase活性,且该活性具有广谱性,并明确了影响该活性的因素,为进一步探究胞外DNase在Pm感染及与宿主互作中的作用提供参考。 展开更多

关键词 多杀性巴氏杆菌 C48-1株 分泌蛋白 DNASE 胞外核酸酶

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赭曲霉毒素A降解菌的分离筛选及生物学特性研究 被引量：2

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作者 唐梦梦 贾艳艳 +5 位作者 廖成水 陈建 刘玉梅 张自强 余祖华 丁轲 《饲料工业》 CAS 北大核心 2023年第10期93-99,共7页

试验旨在筛选出对赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)有降解能力的菌株,以用于赭曲霉毒素A污染的饲料谷物降解。研究采集霉变饲料、土壤等样品,通过在LB培养基中添加OTA制成改良固体培养基进行菌株初筛,以初筛菌株对OTA标准品的降解率为指标... 试验旨在筛选出对赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)有降解能力的菌株,以用于赭曲霉毒素A污染的饲料谷物降解。研究采集霉变饲料、土壤等样品,通过在LB培养基中添加OTA制成改良固体培养基进行菌株初筛,以初筛菌株对OTA标准品的降解率为指标,采用ELISA法进行复筛;通过形态学、生理生化试验、16S rRNA序列分析等方法对筛选菌株进行鉴定,并对筛选菌株进行耐酸、耐胆盐、模拟人工胃液和肠液耐受性、抑菌性及产酶特性等生物学特性进行研究。结果表明:通过筛选获得1株对OTA降解率为86.31%的菌株MM28,鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其在pH2.0的酸性液中存活率为52.13%,0.3%胆盐中存活率可达到65.94%,人工模拟胃液和肠液中存活率分别为50.54%和55.68%。菌株MM28发酵上清液对鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)均有抑制作用。产酶水解圈试验表明,该菌具有产纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶的活性。综上,筛选获得的高效降解OTA的解淀粉芽孢杆菌有一定的抗逆性、抑菌性及产酶性,有望开发成为降解OTA的益生菌用于饲料工业中。 展开更多

关键词 赭曲霉毒素A 分离筛选 解淀粉芽孢杆菌 抑菌 产酶

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鼠伤寒沙门菌SseK1蛋白的表达及其免疫生物学特性研究 被引量：4

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作者 路霞 杨亚东 +2 位作者 郁川 杜付玉 张春杰(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期902-906,921,共6页

目的:研究鼠伤寒沙门菌SseK1蛋白免疫生物学特性及其作为潜在免疫抗原蛋白的可能性。方法:利用PCR方法从鼠伤寒沙门菌SL1344株克隆获得sseK1基因片段,测序分析正确后连接至原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中诱导表... 目的:研究鼠伤寒沙门菌SseK1蛋白免疫生物学特性及其作为潜在免疫抗原蛋白的可能性。方法:利用PCR方法从鼠伤寒沙门菌SL1344株克隆获得sseK1基因片段,测序分析正确后连接至原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中诱导表达。Western blot进一步检测镍离子亲和层析法纯化的SseK1蛋白并进行免疫生物学特性分析。结果:PCR及测序结果表明BL21(pET-32a-SseK1)构建成功。经SDS-PAGE分析显示,表达的SseK1蛋白大小约为43 kD,在原核表达反应器中主要以可溶性形式存在于菌体裂解上清中;经Western blot分析显示,SseK1蛋白可被鼠伤寒沙门菌阳性多抗血清识别,具有良好的反应原性;用SseK1蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,二免后21 d间接ELISA检测的抗体效价高达1∶124000,具有良好的免疫原性。淋巴细胞增殖试验结果表明SseK1能够显著刺激小鼠T淋巴细胞增殖,激发机体细胞免疫应答,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠攻毒及免疫保护试验表明,鼠伤寒沙门菌强毒株对二免14 d后的小鼠攻毒显示60%以上的免疫保护力。结论:本研究表达的SseK1蛋白具有良好的抗原性,为深入研究鼠伤寒沙门菌与机体在感染和免疫方面的相互作用奠定了一定的理论基础。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 SseK1 原核表达 免疫生物学特性

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金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性研究 被引量：1

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作者 李琦 廖成水 +7 位作者 毛福超 王晓利 张梦珂 张晓洁 张春杰 李银聚 吴庭才 程相朝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期175-181,共7页

为研究金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,本研究复苏培养金黄色葡萄球菌后取培养上清液,采用透析得到金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白,结果显示获得的该蛋白浓度为48.5μg/mL。采用琼脂糖凝胶电泳法、琼脂扩散法和琼脂培养法检测金... 为研究金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,本研究复苏培养金黄色葡萄球菌后取培养上清液,采用透析得到金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白,结果显示获得的该蛋白浓度为48.5μg/mL。采用琼脂糖凝胶电泳法、琼脂扩散法和琼脂培养法检测金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,利用琼脂糖凝胶电泳法探究温度、pH、金属离子对核酸酶活性的影响。结果显示,金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白表现出降解λDNA的核酸酶活性,且最适温度和pH值分别为50℃和9.0,在低温和酸性条件下核酸酶的活性较弱,但胞外核酸酶对70℃以上的耐受性较差。不同浓度的Ba^2+、Mg^2+和Zn^2+对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无影响;低浓度(0.01 mmol/L^1 mmol/L)的Ca^2+、Ni^2+、Cu^2+和Mn^4+可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性;高浓度的Na^+、K^+和Fe^3+可以提高胞外核酸酶切割λDNA的活性;添加Co^2+(0.01 mmol/L^10 mmol/L)可以促进胞外分泌蛋白的核酸酶活性。本研究证实了金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,为进一步研究胞外分泌蛋白在金黄色葡萄球菌和宿主互作中的确切作用奠定了基础。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 胞外蛋白 核酸酶 金属离子 活性

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猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响 被引量：2

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作者 李琦 牛俊辉 +6 位作者 王晓利 毛静 全映颖 刘桂坤 雷显前 朱鹏瑶 廖成水 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期733-741,共9页

旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性,同时,分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影... 旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性,同时,分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影响以及胞外产物对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。猪霍乱沙门菌胞外产物具有降解λDNA的DNA酶活性,高温和酸性条件抑制DNA酶的活性,活性最适温度和pH分别为42℃和9.0,且胞外产物的核酸酶可被60℃以上的温度灭活。添加Na^(+)、K^(+)、Ca^(2+)和Ni^(2+)对胞外产物切割λDNA的活性没有影响;5.00和10.00 mmol·L^(-1)的Ba^(2+)、Mg^(2+)和Mn^(2+)可提高胞外产物的DNA酶活性;0.01~1.00 mmol·L^(-1)的Zn^(2+)、Cu^(2+)和Fe^(3+)对胞外产物的DNA酶活性具有促进作用,但Co^(2+)则表现出抑制作用。荧光显微镜和定量分析均显示,猪霍乱沙门菌不能刺激巨噬细胞释放胞外诱捕网,而猪霍乱沙门菌胞外产物可显著降解白色念珠菌刺激巨噬细胞形成的胞外诱捕网。本研究证实了猪霍乱沙门菌胞外产物的DNA酶活性,为进一步探究胞外产物在猪霍乱沙门菌感染与宿主免疫互作中的作用提供参考。 展开更多

关键词 猪霍乱沙门菌 胞外产物 核酸酶 巨噬细胞 胞外诱捕网

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鸡ELAVL 1基因克隆、原核表达及生物信息学分析 被引量：1

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作者 刘佳隆 张译文 +6 位作者 张悦然 孙奇娟 陈建 何雷 贾艳艳 丁轲 余祖华 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期1807-1817,共11页

【目的】试验旨在对鸡胚胎致死性异常视觉蛋白1(embryonic lethal abnormal vision like 1,ELAVL1)基因的CDS区进行克隆、表达和生物信息学分析。【方法】以鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast,CEF)cDNA为模板,通过PCR方法扩增ELAV... 【目的】试验旨在对鸡胚胎致死性异常视觉蛋白1(embryonic lethal abnormal vision like 1,ELAVL1)基因的CDS区进行克隆、表达和生物信息学分析。【方法】以鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast,CEF)cDNA为模板,通过PCR方法扩增ELAVL 1基因CDS区序列,构建pMD19-T-ELAVL1克隆质粒。以pMD19-T-ELAVL1为模板进一步构建pET-32a-ELAVL1原核重组表达质粒,使用IPTG对重组菌株进行诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白表达情况。通过在线软件对ELAVL1蛋白进行生物信息学分析。【结果】鸡ELAVL 1基因CDS区长981 bp,编码326个氨基酸,与鸭的亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。SDS-PAGE和Western blotting结果表明,诱导表达重组蛋白主要以可溶性形式表达,其分子质量大小约55 ku。生物信息学分析显示,ELAVL1蛋白分子质量为36.10 ku,分子式为C_(1587)H_(2494)N_(458)O_(479)S_(14),为非脂溶性、弱碱性的亲水稳定蛋白。ELAVL1蛋白无信号肽与跨膜区,含有1个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、32个磷酸化位点和10个线性B细胞抗原表位结合位点。该蛋白主要位于细胞核中,二级结构及三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,含有3个RNA识别基序(RNA recognition motif,RRM),预测可能与多种RNA结合蛋白和蛋白激酶存在相互作用。【结论】本试验成功克隆了鸡ELAVL 1基因CDS区,其编码蛋白为非脂溶性、弱碱性的亲水稳定蛋白,经诱导表达后成功获得了可溶性表达的ELAVL1重组蛋白。本研究结果为进一步探究鸡ELAVL 1基因功能提供科学依据。 展开更多

关键词 鸡 ELAVL 1基因 克隆 生物信息学分析

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甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌的抗菌活性 被引量：3

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作者 郭晋祥 吕会茹 +3 位作者 李姣锋 廖成水 张琳琳 牛俊辉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第3期1181-1188,共8页

【目的】研究甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌的抗菌活性,为临床合理使用甘草查耳酮A抗感染治疗提供依据。【方法】采用微量肉汤稀释法和平板计数法测定甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,M... 【目的】研究甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌的抗菌活性,为临床合理使用甘草查耳酮A抗感染治疗提供依据。【方法】采用微量肉汤稀释法和平板计数法测定甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC);平板计数法测定1MIC、2MIC、4MIC和8MIC甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌的杀菌效果;吸光光度法测定1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC和1/2MIC甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生长的影响;结晶紫染色法测定1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和1MIC的甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生物被膜的抑制效果以及1/4MIC、1/2MIC、1MIC和1MBC甘草查耳酮A对生物被膜的清除效果;建立小鼠皮肤刀伤模型和皮肤脓肿模型评价甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌感染小鼠的治疗效果。【结果】甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌临床分离菌株具有良好的抗菌活性,MIC和MBC分别为3.125和12.5μg/mL。时间-杀菌曲线结果显示,2MIC和1MIC组在6 h内铜绿假单胞菌数量逐渐减少,之后基本维持在1×10^(5) CFU/mL左右;8MIC和4MIC组铜绿假单胞菌的数量一直处于下降趋势,并且分别在14和16 h后均无菌落形成。1/16MIC甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生长影响不明显,而1/8MIC、1/4MIC和1/2MIC甘草查耳酮A可抑制细菌生长。1MIC甘草查耳酮A对铜绿假单胞菌生物被膜形成的抑制率约为70%,1MBC甘草查耳酮A可清除约50%预形成的生物被膜。体内试验结果表明,甘草查耳酮A有助于铜绿假单胞菌感染小鼠刀伤的创口愈合,并减少皮肤脓肿。与对照组相比,甘草查耳酮A和氨苄西林组脓肿中的细菌数量均极显著减少(P<0.01)。【结论】甘草查耳酮A对貂源铜绿假单胞菌具有良好的体外和体内抗菌活性,可进一步用于临床治疗铜绿假单胞菌感染制剂的研发。 展开更多

关键词 甘草查耳酮A 铜绿假单胞菌 水貂 抗菌活性

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