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铜绿假单胞菌flgE基因菊粉季铵盐纳米DNA的制备与免疫效果研究 被引量：3
1
作者 宫强 李雅静 +2 位作者 翟文汉 牛明福 秦翠丽 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期985-990,共6页
为提高铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫效果,本实验对菊粉进行阳离子化后获得带正电荷的菊粉季铵盐,以其包裹裸DNA疫苗后制备成菊粉季铵盐纳米DNA疫苗,结果显示,flgE基因壳菊粉季铵盐纳米DNA疫苗在扫描电镜下呈现较为规则的圆球型,粒... 为提高铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫效果,本实验对菊粉进行阳离子化后获得带正电荷的菊粉季铵盐,以其包裹裸DNA疫苗后制备成菊粉季铵盐纳米DNA疫苗,结果显示,flgE基因壳菊粉季铵盐纳米DNA疫苗在扫描电镜下呈现较为规则的圆球型,粒径100 nm~200 nm。以裸DNA疫苗和菊粉季铵盐纳米DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,同时设置灭活疫苗、pcDNA3.1(+)空载体和PBS对照组。免疫1周时经断尾采血并分离血清,采用间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,结果显示小鼠免疫后菊粉季铵盐纳米DNA疫苗诱导的血清抗体水平虽低于灭活疫苗,但明显高于裸DNA疫苗(p<0.05)。同时每次免疫2周后,每组各随机取5只小鼠分离制备脾淋巴细胞悬液,采用MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA测定脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2的水平,结果显示,纳米DNA疫苗组小鼠的刺激指数(SI)及脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2含量与灭活疫苗组相当,显著高于裸DNA疫苗组(p<0.05)。三免2周后以1.8×10^(10)cfu/只铜绿假单胞菌CAU0792菌液攻击各组小鼠,且计算存活数及保护率,结果显示灭活疫苗组、菊粉季铵盐纳米DNA疫苗组和裸DNA疫苗组的保护率分别为90%、75%和55%,表明菊粉季铵盐可增强裸DNA疫苗诱导的免疫应答水平和保护效果。本实验首次将菊粉进行季铵盐化后使其带有正电荷,有利于结合DNA分子形成纳米颗粒,从而增强了DNA疫苗的免疫原性,为铜绿假单胞菌DNA疫苗的研制及新型DNA疫苗佐剂的开发奠定了基础。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 菊粉季铵盐 纳米DNA疫苗 免疫效果
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铜绿假单胞菌oprD基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗的免疫效果研究 被引量：4
2
作者 宫强 翟文汉 +1 位作者 李雅静 田佳雨 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第8期868-874,共7页
为探究铜绿假单胞菌oprD基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增铜绿假单胞菌oprD基因,将其克隆于真核表达载体pcaggs-HA中,构建重组质粒pOPRD。同时将oprD基因克隆于原核表达载体pET32a中构建重组质粒,随后将该重组质... 为探究铜绿假单胞菌oprD基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增铜绿假单胞菌oprD基因,将其克隆于真核表达载体pcaggs-HA中,构建重组质粒pOPRD。同时将oprD基因克隆于原核表达载体pET32a中构建重组质粒,随后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行蛋白表达并纯化后制备该基因的重组亚单位疫苗。分别以pOPRD质粒和重组亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠,同时设置pOPRD初免-重组亚单位疫苗加强免疫组、灭活疫苗(本研究室制备)免疫组、铜绿假单胞菌外膜蛋白(本研究室制备)免疫组以及pcaggs-HA空载体对照组和PBS对照组。免疫后采用间接ELISA测定小鼠血清抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA测定脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4的水平。结果显示各疫苗均可诱导免疫小鼠产生较高水平的血清抗体,初免-加强免疫组小鼠脾细胞的增殖指数(SI)值及小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-4含量显著高于DNA疫苗组和重组亚单位疫苗组(P<0.05)。三免两周后以铜绿假单胞菌强毒株CAV0792对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率,结果显示DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组、初免-加强免疫组、外膜蛋白疫苗组和灭活疫苗组的保护率分别为53.3%、60%、73.3%、80%和93.3%。本研究首次证实以铜绿假单胞菌oprD基因制备的DNA疫苗和重组亚单位疫苗均可诱导小鼠产生免疫应答,并为其提供对铜绿假单胞菌感染的免疫保护,且两者以初免-加强免疫的方式诱导的免疫应答水平更高、保护效果更好。本研究为铜绿假单胞菌DNA疫苗和重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 oprD基因 DNA疫苗 重组亚单位疫苗 初免-加强免疫
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铜绿假单胞菌oprL和oprF基因二价组合DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫效果的研究 被引量：1
3
作者 宫强 翟文汉 +1 位作者 郭利娜 杜珍奇 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期77-82,共6页
为探索铜绿假单胞菌oprL和oprF基因的二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF初免-灭活疫苗加强免疫的效果,本实验以铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF免疫BALB/c小鼠后再以灭活疫苗加强免疫,根据两种疫苗的免疫次数分为初免-加强免疫1组和初... 为探索铜绿假单胞菌oprL和oprF基因的二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF初免-灭活疫苗加强免疫的效果,本实验以铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF免疫BALB/c小鼠后再以灭活疫苗加强免疫,根据两种疫苗的免疫次数分为初免-加强免疫1组和初免-加强免疫2组,同时设置二价组合DNA疫苗单独免疫组、灭活疫苗单独免疫组以及生理盐水对照组。免疫后间接ELISA法测定小鼠血清抗体水平、MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗体夹心ELISA测定小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。三免两周后将铜绿假单胞菌以1.35×10^(10) cfu/只的剂量对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率。结果显示DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫诱导的小鼠血清抗体水平、刺激指数(SI)值及小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于DNA疫苗单独免疫组(p<0.05)。且初免-加强免疫1组小鼠的SI值及分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于灭活疫苗组(p<0.05),但各组小鼠分泌的IL-4含量无显著差异(p>0.05)。初免-加强免疫1组、初免-加强免疫2组、灭活疫苗组和DNA疫苗单独组的保护率分别为92%、80%、84%和72%。表明二价组合DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫策略可以诱导小鼠产生较高水平的抗体和Th1型细胞免疫应答,并可为小鼠提供较好的保护率。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 pOPRL+pOPRF DNA疫苗 灭活疫苗 初免-加强免疫
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铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF最佳免疫剂量研究
4
作者 宫强 阮梦蝶 +1 位作者 郭洁真 杜珍奇 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期539-543,共5页
目的探讨铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF在小鼠体内的最佳免疫剂量。方法分别以25μg,50μg,100μg和200μg的pOPRL+pOPRF免疫BALB/c小鼠。对各剂量免疫后诱导的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平以及IFN-γ和Il-2分泌水平进... 目的探讨铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF在小鼠体内的最佳免疫剂量。方法分别以25μg,50μg,100μg和200μg的pOPRL+pOPRF免疫BALB/c小鼠。对各剂量免疫后诱导的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平以及IFN-γ和Il-2分泌水平进行检测,强毒攻击后测定各组小鼠的存活时间及保护率。结果 100μg和200μg组小鼠的血清特异性抗体水平、SI值及IFN-γ和Il-2的分泌水平明显高于25μg和50μg组(F=8.414,P<0.05)。且三免后100μg组小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和Il-2的量高于200μg组(F=6.375,P<0.05)。攻毒后25μg、50μg、100μg和200μg组的保护率分别为35%、45%、85%和70%。结论 pOPRL+pOPRF二价组合DNA的免疫效果与免疫剂量有一定的相关性,在小鼠中的最佳免疫剂量为100μg。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 pOPRL+pOPRF DNA疫苗 免疫效果 免疫剂量
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铜绿假单胞菌oprI基因DNA疫苗及其重组亚单位疫苗免疫效果的评估 被引量：1
5
作者 祝世纪 宫强 +1 位作者 田佳雨 李雅静 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期285-291,共7页
为评估铜绿假单胞菌opr I基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗对小鼠的免疫效果,本实验将铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因opr I克隆至真核表达载体p CAGGS-HA中构建重组质粒p CAGGS-opr I,经酶切鉴定正确后获得DNA疫苗。同时将opr I基因克隆至原... 为评估铜绿假单胞菌opr I基因DNA疫苗和重组亚单位疫苗对小鼠的免疫效果,本实验将铜绿假单胞菌外膜蛋白编码基因opr I克隆至真核表达载体p CAGGS-HA中构建重组质粒p CAGGS-opr I,经酶切鉴定正确后获得DNA疫苗。同时将opr I基因克隆至原核表达载体p ET32a中构建重组质粒p ET32a-oprI,经酶切鉴定正确后转入大肠杆菌,经IPTG诱导重组Opr I蛋白(rOprI)的表达,采用亲和层析法纯化后以SDS-PAGE检测,结果显示正确表达了r Opr I,且获得了其纯化蛋白,利用其制备重组亚单位疫苗。分别以DNA疫苗和重组亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠,并以铜绿假单胞菌的灭活疫苗和外膜蛋白疫苗为对照,采用间接ELISA法检测免疫后不同时间小鼠血清中的抗体水平和血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的含量;初免42 d后以铜绿假单胞菌(1.25×109 cfu/mL,100μL/只)对各组小鼠进行攻毒试验,通过测定各疫苗对小鼠的保护率,评估疫苗的保护效果。结果显示,各疫苗诱导的免疫小鼠血清抗体水平和细胞因子含量均显著高于阴性对照组(P<0.05),且重组亚单位疫苗诱导小鼠的抗体水平和IL-4含量均显著高于DNA疫苗(P<0.05),而IFN-γ和IL-2含量则与DNA疫苗无显著差异(P>0.05)。小鼠攻毒试验结果显示,DNA疫苗组、重组亚单位疫苗组、外膜蛋白疫苗组和灭活疫苗组小鼠获得的免疫保护率分别为45%、55%、70%和95%。上述结果首次表明以铜绿假单胞菌opr I基因制备的DNA疫苗和r Opr I重组亚单位疫苗均可诱导小鼠产生体液和细胞免疫应答,并可为小鼠提供对铜绿假单胞菌攻毒的免疫保护效果,但二者的免疫效果还需进一步提高。本研究为铜绿假单胞菌疫苗的研究提供了参考依据。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 oprI基因 DNA疫苗 重组亚单位疫苗 免疫效果
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铜绿假单胞菌flg E基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果评估 被引量：2
6
作者 宫强 李雅静 +2 位作者 翟文汉 祝世纪 田佳雨 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期510-516,共7页
为评价铜绿假单胞菌flgE基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增flgE基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建flgE基因的重组质粒pflgE,进一步以壳聚糖为佐剂制备了纳米DNA疫苗CpflgE,通过测定OD260nm值检测纳米DNA疫苗... 为评价铜绿假单胞菌flgE基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果,本研究经PCR扩增flgE基因,将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建flgE基因的重组质粒pflgE,进一步以壳聚糖为佐剂制备了纳米DNA疫苗CpflgE,通过测定OD260nm值检测纳米DNA疫苗的包封率、加入DNA酶后经琼脂糖凝胶电泳检测其抗DNA酶降解的能力、37℃恒温静置1 d,3 d和5 d后经琼脂糖凝胶电泳检测稳定性。结果显示CpflgE的包封率为94.69%,可有效抵抗DNaseⅠ的降解,具有较强的稳定性。以pflgE和CpflgE免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,同时设置灭活疫苗免疫组、铜绿假单胞菌鞭毛蛋白亚单位疫苗免疫组以及PBS对照组。免疫后不同时间经间接ELISA测定各组小鼠血清抗体水平,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,采用检测试剂盒测定各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。结果显示,Cpflg E诱导小鼠的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度总体上虽均低于灭活疫苗,但与鞭毛蛋白亚单位疫苗相当,且显著高于pflgE (P<0.05)。三免两周后以铜绿假单胞菌强毒株(1.35×10^(10)cfu)对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率,结果显示,pflgE组、CpflgE组、鞭毛蛋白疫苗组和灭活疫苗组的保护率分别为57.1%、76.2%、81%和95.2%。本研究首次证实壳聚糖作为载体和佐剂可以显著提高铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗诱导的免疫应答水平,为铜绿假单胞菌新型DNA疫苗的研制提供了参考依据。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 flgE基因 裸DNA疫苗 壳聚糖纳米DNA疫苗 免疫效果
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自酿葡萄酒香气成分的多萃取方法分析 被引量：1
7
作者 邱智军 陈艳楠 +1 位作者 原江锋 张彬 《河南科技大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2022年第5期77-83,M0007,共8页
为了更全面地评价自酿葡萄酒香气品质,采用液-液萃取法(LLE)、水蒸气蒸馏法(SDE)和顶空固相微萃取法(SPME)结合气相色谱-质谱联用仪(GC-MS),对陈酿半年和陈酿一年半自酿葡萄酒香气成分进行分析,对比研究3种方法对自酿葡萄酒香气成分萃... 为了更全面地评价自酿葡萄酒香气品质,采用液-液萃取法(LLE)、水蒸气蒸馏法(SDE)和顶空固相微萃取法(SPME)结合气相色谱-质谱联用仪(GC-MS),对陈酿半年和陈酿一年半自酿葡萄酒香气成分进行分析,对比研究3种方法对自酿葡萄酒香气成分萃取的效果和特点。研究结果表明:LLE富集鉴定到31个香气化合物种类,SDE仅能富集鉴定到12种相对百分含量较高的香气成分,而SPME能富集鉴定到多达36种香气成分。在LLE和SPME富集鉴定到的58种香气成分中,有31种化合物不能被两种方法单独使用时同时得到。在提取效率方面,LLE和SPME表现出很强的互补作用,两者联合使用大大提高了自酿葡萄酒香气成分的提取效率,获得的香气物质种类更加全面。随着自酿葡萄酒陈酿时间的增长,香气成分种类和相对百分含量上有着明显的差异和变化,其中包括糠醛等有害物质相对百分含量升高,因此,自酿葡萄酒的饮用也须充分考虑适饮期和陈年能力。 展开更多
关键词 自酿葡萄酒香气物质 顶空固相微萃取 液-液萃取 水蒸气蒸馏法 气质联用
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铜绿假单胞菌flgE基因PCR检测方法的初步建立
8
作者 宫强 杜珍奇 +4 位作者 冯礼尚 樊泽军 冯洋洋 孙鹏飞 程梦琦 《现代畜牧兽医》 2020年第3期1-6,共6页
为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物... 为建立一种基于铜绿假单胞菌flgE基因的PCR检测方法,本试验根据GenBank中已发表的铜绿假单胞菌flgE基因序列,设计合成了1对特异性引物,由铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增获得了目的基因。从退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度5个方面优化了反应条件,并检测了该方法的特异性和敏感性。结果成功扩增出了铜绿假单胞菌1 400 bp的flgE特异性基因片段,最佳退火温度、循环次数、Mg2+浓度、dNTPs浓度和引物浓度分别为56℃、30个循环、1.6 mmol/L、0.2 mmol/L和0.3μmol/L。特异性试验表明,仅铜绿假单胞菌中可扩增出目的片段,而多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中均未扩增出相应片段。敏感性试验结果表明,本方法可检测到最低10 pg/μL的铜绿假单胞菌基因组DNA以及100 CFU/mL的病原菌。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 flgE基因 PCR 检测方法
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