貂源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及胞外分泌蛋白的核酸酶活性分析 被引量：1

1

作者 贾艳艳 李琦 +5 位作者 王晓利 牛俊辉 毛静 廖成水 张昊恺 张明亮 《河南农业科学》 北大核心 2021年第3期142-147,共6页

为确定引起水貂肺炎的病原菌,对从临床死亡病例中分离到的1株疑似肺炎克雷伯菌进行鉴定,采用琼脂糖凝胶电泳法检测肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,并探究了温度、pH值、金属离子对核酸酶活性的影响。结果显示,通过病料涂片镜检及... 为确定引起水貂肺炎的病原菌,对从临床死亡病例中分离到的1株疑似肺炎克雷伯菌进行鉴定,采用琼脂糖凝胶电泳法检测肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,并探究了温度、pH值、金属离子对核酸酶活性的影响。结果显示,通过病料涂片镜检及PCR鉴定,分离株为1株肺炎克雷伯菌,该肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白表现出降解λDNA的核酸酶活性,最适温度为30~37℃,最适pH值为7.0,在高温和碱性条件的反应环境时核酸酶的活性较弱。一价金属离子(Na^(+)、K^(+))和部分二价金属离子(Ca^(2+)、Ba^(2+)、Ni^(2+)、Zn^(2+)和Cu^(2+))对肺炎克雷伯菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性无明显影响,而5.00~10.00 mmol/L的Co^(2+)和Fe^(3+)以及10.00 mmol/L的Mg^(2+)和Mn^(2+)可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性。综上,从临床水貂肺炎病例中分离到1株肺炎克雷伯菌,并证实该菌胞外分泌蛋白具有核酸酶活性。 展开更多

关键词 水貂 肺炎克雷伯菌 分离鉴定 胞外分泌蛋白 核酸酶

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巨噬细胞极化在微生物感染中的作用研究进展 被引量：1

2

作者 廖成水 毛福超 程相朝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期323-327,共5页

巨噬细胞(Macrophage)起源于骨髓中的前体细胞,分化成熟的巨噬细胞广泛分布于机体各个组织和器官中[1]。在特定因素作用下,机体内某些细胞可以直接分化成为巨噬细胞,不同细胞分化后的巨噬细胞可以分布于不同组织[2]。巨噬细胞是参与机... 巨噬细胞(Macrophage)起源于骨髓中的前体细胞,分化成熟的巨噬细胞广泛分布于机体各个组织和器官中[1]。在特定因素作用下,机体内某些细胞可以直接分化成为巨噬细胞,不同细胞分化后的巨噬细胞可以分布于不同组织[2]。巨噬细胞是参与机体固有免疫的一类重要免疫细胞,不但可以吞噬外来微生物,还能递呈抗原,通过合成分泌多种细胞因子发挥功效,在控制炎症变化的过程中起到主导作用。当外界病原体侵入机体引发感染时,机体的无菌环境被打破,巨噬细胞被激活后识别病原体和抗原递呈,吞噬杀灭病原体起到免疫保护作用。 展开更多

关键词 肝巨噬细胞 炎症反应 巨噬细胞极化 戈登氏链球菌 寄生虫感染 微生物感染

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鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征及其蛋白核酸酶活性分析

3

作者 张梦珂 廖成水 +5 位作者 毛福超 王晓利 李银聚 吴庭才 张春杰 程相朝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第8期675-679,共5页

为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征,本研究应用PCR扩增得到鼠伤寒沙门菌SL1344株的5'-nucleotidase基因片段,利用在线网站和DNAMAN 6.0.3.48软件进行其核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。然后将目的基因亚克隆至... 为研究鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因的序列特征,本研究应用PCR扩增得到鼠伤寒沙门菌SL1344株的5'-nucleotidase基因片段,利用在线网站和DNAMAN 6.0.3.48软件进行其核苷酸和氨基酸序列的同源性分析。然后将目的基因亚克隆至原核表达载体p ET32a构建重组表达质粒(pET32a-5'-nucleotidase),转入大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导表达,亲和层析法纯化后采用SDS-PAGE和western blot进行分析。采用酶切活性试验分析重组蛋白的核酸酶活性。结果显示,鼠伤寒沙门菌SL1344株5'-nucleotidase基因为1 482 bp,5'-nucleotidase核苷酸序列与其它22种微生物的5'-nucleotidase及其类似物的同源性较低,最高仅为52.8%。理论上蛋白的分子量为57.18 ku,编码523个氨基酸。SDS-PAGE和western blot结果显示5'-nucleotidase重组蛋白约72 ku,且以可溶性和包涵体两种形式表达。同时,酶切活性试验结果显示重组5'-nucleotidase蛋白具有降解DNA的能力。本实验克隆了鼠伤寒沙门菌5'-nucleotidase基因,并表达得到了具有核酸酶活性的重组蛋白,为进一步研究5'-nucleotidase基因在鼠伤寒沙门菌感染中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 5'-nucleotidase基因 克隆 序列分析 原核表达

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鼠伤寒沙门菌SseK1蛋白的表达及其免疫生物学特性研究 被引量：5

4

作者 路霞 杨亚东 +2 位作者 郁川 杜付玉 张春杰(指导) 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期902-906,921,共6页

目的:研究鼠伤寒沙门菌SseK1蛋白免疫生物学特性及其作为潜在免疫抗原蛋白的可能性。方法:利用PCR方法从鼠伤寒沙门菌SL1344株克隆获得sseK1基因片段,测序分析正确后连接至原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中诱导表... 目的:研究鼠伤寒沙门菌SseK1蛋白免疫生物学特性及其作为潜在免疫抗原蛋白的可能性。方法:利用PCR方法从鼠伤寒沙门菌SL1344株克隆获得sseK1基因片段,测序分析正确后连接至原核表达载体pET-32a(+),并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中诱导表达。Western blot进一步检测镍离子亲和层析法纯化的SseK1蛋白并进行免疫生物学特性分析。结果:PCR及测序结果表明BL21(pET-32a-SseK1)构建成功。经SDS-PAGE分析显示,表达的SseK1蛋白大小约为43 kD,在原核表达反应器中主要以可溶性形式存在于菌体裂解上清中;经Western blot分析显示,SseK1蛋白可被鼠伤寒沙门菌阳性多抗血清识别,具有良好的反应原性;用SseK1蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠,二免后21 d间接ELISA检测的抗体效价高达1∶124000,具有良好的免疫原性。淋巴细胞增殖试验结果表明SseK1能够显著刺激小鼠T淋巴细胞增殖,激发机体细胞免疫应答,差异具有统计学意义(P<0.05)。小鼠攻毒及免疫保护试验表明,鼠伤寒沙门菌强毒株对二免14 d后的小鼠攻毒显示60%以上的免疫保护力。结论:本研究表达的SseK1蛋白具有良好的抗原性,为深入研究鼠伤寒沙门菌与机体在感染和免疫方面的相互作用奠定了一定的理论基础。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 SseK1 原核表达 免疫生物学特性

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金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性研究 被引量：1

5

作者 李琦 廖成水 +7 位作者 毛福超 王晓利 张梦珂 张晓洁 张春杰 李银聚 吴庭才 程相朝 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期175-181,共7页

为研究金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,本研究复苏培养金黄色葡萄球菌后取培养上清液,采用透析得到金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白,结果显示获得的该蛋白浓度为48.5μg/mL。采用琼脂糖凝胶电泳法、琼脂扩散法和琼脂培养法检测金... 为研究金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,本研究复苏培养金黄色葡萄球菌后取培养上清液,采用透析得到金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白,结果显示获得的该蛋白浓度为48.5μg/mL。采用琼脂糖凝胶电泳法、琼脂扩散法和琼脂培养法检测金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,利用琼脂糖凝胶电泳法探究温度、pH、金属离子对核酸酶活性的影响。结果显示,金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白表现出降解λDNA的核酸酶活性,且最适温度和pH值分别为50℃和9.0,在低温和酸性条件下核酸酶的活性较弱,但胞外核酸酶对70℃以上的耐受性较差。不同浓度的Ba^2+、Mg^2+和Zn^2+对胞外分泌蛋白的核酸酶活性无影响;低浓度(0.01 mmol/L^1 mmol/L)的Ca^2+、Ni^2+、Cu^2+和Mn^4+可以促进胞外核酸酶切割λDNA的活性;高浓度的Na^+、K^+和Fe^3+可以提高胞外核酸酶切割λDNA的活性;添加Co^2+(0.01 mmol/L^10 mmol/L)可以促进胞外分泌蛋白的核酸酶活性。本研究证实了金黄色葡萄球菌胞外分泌蛋白的核酸酶活性,为进一步研究胞外分泌蛋白在金黄色葡萄球菌和宿主互作中的确切作用奠定了基础。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 胞外蛋白 核酸酶 金属离子 活性

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猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响 被引量：2

6

作者 李琦 牛俊辉 +6 位作者 王晓利 毛静 全映颖 刘桂坤 雷显前 朱鹏瑶 廖成水 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期733-741,共9页

旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性,同时,分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影... 旨在探究猪霍乱沙门菌胞外产物的核酸酶活性及其对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。采用平板培养法、琼脂糖凝胶电泳法和琼脂扩散法观察猪霍乱沙门菌胞外产物降解λDNA的活性,同时,分析不同温度、pH和金属离子对胞外产物核酸酶活性的影响以及胞外产物对巨噬细胞胞外诱捕网形成的影响。猪霍乱沙门菌胞外产物具有降解λDNA的DNA酶活性,高温和酸性条件抑制DNA酶的活性,活性最适温度和pH分别为42℃和9.0,且胞外产物的核酸酶可被60℃以上的温度灭活。添加Na^(+)、K^(+)、Ca^(2+)和Ni^(2+)对胞外产物切割λDNA的活性没有影响;5.00和10.00 mmol·L^(-1)的Ba^(2+)、Mg^(2+)和Mn^(2+)可提高胞外产物的DNA酶活性;0.01~1.00 mmol·L^(-1)的Zn^(2+)、Cu^(2+)和Fe^(3+)对胞外产物的DNA酶活性具有促进作用,但Co^(2+)则表现出抑制作用。荧光显微镜和定量分析均显示,猪霍乱沙门菌不能刺激巨噬细胞释放胞外诱捕网,而猪霍乱沙门菌胞外产物可显著降解白色念珠菌刺激巨噬细胞形成的胞外诱捕网。本研究证实了猪霍乱沙门菌胞外产物的DNA酶活性,为进一步探究胞外产物在猪霍乱沙门菌感染与宿主免疫互作中的作用提供参考。 展开更多

关键词 猪霍乱沙门菌 胞外产物 核酸酶 巨噬细胞 胞外诱捕网

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携带NDV HN 基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统构建及其生物学特性分析 被引量：2

7

作者 宋敏杰 周小双 +4 位作者 石胜丽 朱文文 田文静 程相朝 郁川 《河南农业科学》 北大核心 2021年第10期116-123,共8页

为构建能稳定携带新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin‑neuraminidase protein,HN)基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统,从pMD18-T-HN中扩增出NDV HN基因,并将其克隆入载体pYA3493-sopENt100,... 为构建能稳定携带新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(Hemagglutinin‑neuraminidase protein,HN)基因的减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统,从pMD18-T-HN中扩增出NDV HN基因,并将其克隆入载体pYA3493-sopENt100,构建重组载体pYA3493-sopENt100-HN,然后将其电转化至减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,并对其重组菌的生长特性、遗传稳定性、表达特性和毒力特性等进行分析。结果显示,携带NDV HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100-HN)构建成功;重组菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100-HN)的生长趋势与互补菌ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100)和缺失菌ΔcrpΔasd SL1344相似,与亲本菌株SL1344有明显差异;重组菌能够稳定表达HN基因;减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统能够有效递呈HN基因,并诱导其在鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast,CEF)内表达;重组菌的LD_(50)与互补菌和缺失菌没有明显差异,与亲本菌株SL1344差异较大。以上结果表明,成功构建了携带NDV HN基因的新型减毒鼠伤寒沙门菌Ⅲ型分泌系统ΔcrpΔasd SL1344(pYA3493-sopENt100-HN),能够有效递呈NDV HN基因并使其高效表达,且安全性高,遗传稳定。 展开更多

关键词 新城疫病毒 HN 基因 Ⅲ型分泌系统 减毒沙门菌 生物学特性

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鼠伤寒沙门菌重组鞭毛蛋白对巨噬细胞细胞因子与氧化/抗氧化水平的影响 被引量：3

8

作者 王晓利 廖成水 +3 位作者 路霞 崔淹鸽 王安琪 王臣 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期528-533,共6页

为研究重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白对巨噬细胞细胞因子与氧化/抗氧化水平的影响,本研究将50 ng/mL、250 ng/mL和500 ng/mL重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC分别与巨噬细胞J774.1共孵育,分别采用CCK-8法、LDH试剂盒、ELISA试剂盒和荧光显微镜... 为研究重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白对巨噬细胞细胞因子与氧化/抗氧化水平的影响,本研究将50 ng/mL、250 ng/mL和500 ng/mL重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC分别与巨噬细胞J774.1共孵育,分别采用CCK-8法、LDH试剂盒、ELISA试剂盒和荧光显微镜检测巨噬细胞活力、巨噬细胞上清乳酸脱氢酶(LDH)、巨噬细胞分泌细胞因子和巨噬细胞胞内活性氧(ROS)水平;采用商品化试剂盒检测巨噬细胞产生的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)等氧化/抗氧化水平。结果显示,50 ng/mL重组鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白对巨噬细胞活力无影响,而巨噬细胞活力在该蛋白浓度为250 ng/mL(12 h)和500 ng/mL(9 h)时明显下降。该重组蛋白对巨噬细胞上清LDH水平的影响随其浓度的增加呈上升趋势,同时该重组蛋白的浓度对巨噬细胞分泌IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和TGF-β的影响也呈正相关趋势。荧光显微镜检测显示,该重组蛋白刺激巨噬细胞胞内ROS水平明显增强。氧化/抗氧化水平方面,该重组蛋白导致巨噬细胞iNOS、MDA和NO氧化水平升高,而GSH-PX、SOD和T-AOC抗氧化水平降低。综上所述,鼠伤寒沙门菌重组鞭毛蛋白能增强巨噬细胞分泌细胞因子,也可引起巨噬细胞氧化/抗氧化平衡失调,为进一步探究鼠伤寒沙门菌与宿主的互作提供参考。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 鞭毛蛋白 巨噬细胞 细胞因子 氧化/抗氧化

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Ⅲ型分泌系统在沙门菌囊泡形成中的作用研究进展 被引量：1

9

作者 王晓利 杜付玉 廖成水 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期106-109,共4页

沙门菌是一种兼性胞内革兰氏阴性病原菌,是世界上公认的主要食源性病原菌[1]。全球沙门菌感染人数呈逐年上升趋势,在一些不发达地区的感染最为严重,且可发生于各个年龄段人群。沙门菌感染机体后通过网状内皮系统传播,定居于巨噬细胞、... 沙门菌是一种兼性胞内革兰氏阴性病原菌,是世界上公认的主要食源性病原菌[1]。全球沙门菌感染人数呈逐年上升趋势,在一些不发达地区的感染最为严重,且可发生于各个年龄段人群。沙门菌感染机体后通过网状内皮系统传播,定居于巨噬细胞、树突状细胞、多形核白细胞和肝细胞以及其他非专业性吞噬细胞。沙门菌的毒力对于吞噬细胞内细菌的存活至关重要。 展开更多

关键词 多形核白细胞 沙门菌 Ⅲ型分泌系统 网状内皮系统 吞噬细胞 食源性病原菌 树突状细胞 不发达地区

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旋毛虫plancitoxin-1-like基因的序列分析与编码蛋白结构预测

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作者 廖成水 王晓利 +7 位作者 田文静 杨亚东 张梦珂 王安琪 张春杰 刘明远 Boireau Pascal 程相朝 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期218-222,共5页

基因组预测旋毛虫拥有125种庞大的DNase II家族蛋白,但只有plancitoxin-1唯一在C端含有一个保守的DNase II活性位点(HKD基序)。为研究旋毛虫plancitoxin-1基因的序列结构特征,以旋毛虫总RNA为模板进行RT-PCR,获得plancitoxin-1基因的序... 基因组预测旋毛虫拥有125种庞大的DNase II家族蛋白,但只有plancitoxin-1唯一在C端含有一个保守的DNase II活性位点(HKD基序)。为研究旋毛虫plancitoxin-1基因的序列结构特征,以旋毛虫总RNA为模板进行RT-PCR,获得plancitoxin-1基因的序列,并利用生物信息学方法进行系统性分析。结果显示,扩增得到的核苷酸序列比GenBank中相关序列短210bp,编码294个氨基酸,由20种氨基酸组成,重新命名为plancitoxin-1-like,且氨基酸序列中在N端和C端都具有HKD基序。蛋白质理论相对分子质量为33.19ku,等电点为9.17,是稳定存在的亲水性蛋白。Plancitoxin-1-like的氨基酸序列与其他物种DNase II的相似性为35%左右。Plancitoxin-1-like含有4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、31个磷酸化位点、17个B细胞线性结合位点和9个T细胞结合位点以及3个二硫键。二级结构中,α-螺旋占14.29%(42个),延伸链占28.23%(83个),无规卷曲占55.10%(162个)。本研究成功克隆旋毛虫plancitoxin-1-like基因,对其序列结构进行分析,为进一步研究庞大的DNase II家族蛋白在旋毛虫发育和感染中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 旋毛虫 DNASE II 克隆 生物信息学

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甘草多糖对小鼠及鼠伤寒沙门菌生长性能的影响 被引量：7

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作者 付道斌 廖成水 +4 位作者 路霞 王晓利 辛玲 肖宜航 宋香朋 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第6期139-143,共5页

为探讨甘草多糖对小鼠及鼠伤寒沙门菌生长性能的影响,利用小鼠灌胃给予低剂量(1 mg/kg)、中剂量(10 mg/kg)和高剂量(100 mg/kg)甘草多糖,测定小鼠生长性能(体质量和脏器指数)变化;在培养基中分别加入终质量浓度为10、20、50、100、200μ... 为探讨甘草多糖对小鼠及鼠伤寒沙门菌生长性能的影响,利用小鼠灌胃给予低剂量(1 mg/kg)、中剂量(10 mg/kg)和高剂量(100 mg/kg)甘草多糖,测定小鼠生长性能(体质量和脏器指数)变化;在培养基中分别加入终质量浓度为10、20、50、100、200μg/mL的甘草多糖,检测其对鼠伤寒沙门菌体外生长的影响;Bliss法计算鼠伤寒沙门菌对小鼠半数致死量(LD_(50));检测甘草多糖对小鼠感染100倍LD_(50)鼠伤寒沙门菌的保护力。给予甘草多糖后所有剂量组小鼠一般临床状况均无明显变化,体质量和脏器(肝脏、肺脏、心脏、肾脏和胸腺)指数稍有增高。而第5天和第7天时甘草多糖可显著增加小鼠的脾脏指数(P<0.05)。甘草多糖可促进鼠伤寒沙门菌的生长速率和生物被膜的形成,但差异不显著。鼠伤寒沙门菌腹腔感染小鼠的LD_(50)为2.09×10~5cfu/mL。100倍LD_(50)的鼠伤寒沙门菌感染小鼠后,随着甘草多糖质量浓度增加小鼠死亡时间延迟。结果表明,甘草多糖对鼠伤寒沙门菌体外生长具有有限的促进作用,对小鼠生长性能无显著性影响,但可以提高小鼠抵抗鼠伤寒沙门菌感染的能力。 展开更多

关键词 甘草多糖 小鼠 生长性能 鼠伤寒沙门菌 生物被膜

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