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大口黑鲈铜绿假单胞菌的分离鉴定与抗菌药物筛选
1
作者 姚清 潘创业 +1 位作者 姚伦广 邱礽 《江苏农业科学》 北大核心 2025年第1期231-237,共7页
为研究导致河南省某养殖场大口黑鲈皮肤溃烂并死亡的病因并从中分离优势感染菌株,从中获取大口黑鲈爆发该病的试验数据,达到预防与治疗的的目的。首先通过显微镜观察和分子生物学等手段排除寄生虫病和病毒感染的可能性,排除之后在患病... 为研究导致河南省某养殖场大口黑鲈皮肤溃烂并死亡的病因并从中分离优势感染菌株,从中获取大口黑鲈爆发该病的试验数据,达到预防与治疗的的目的。首先通过显微镜观察和分子生物学等手段排除寄生虫病和病毒感染的可能性,排除之后在患病大口黑鲈的肝脏和脾脏中,分离出1株优势菌株NY22101804,经过形态观察与通过生理生化试验分析和检测菌液16SrDNA基因序列并比对构建进化树分析,确认菌株类型,再通过人工回归感染试验验证致病性并通过纸片扩散法和牛津杯法测定了该菌对抗生素和中药单体的药物敏感性对药物进行筛选。结果显示,该菌为铜绿假单胞菌株,通过人工回感试验发现,NY22101804对大口黑鲈具有急性致死效应,死亡率与浓度有依赖性呈正相关变化,通过药敏试验数据发现,菌液对妥布霉素、四环素等10种抗生素敏感,对青霉素、氨卡西林等9种抗生素具有耐药性,在中药单体的测试中,黄芩素表现出最好的抑菌效果,其他如黄芩苷、柚皮素、芸香苷等也显示出不同程度的抑菌活性。 展开更多
关键词 大口黑鲈 铜绿假单胞菌 药物敏感性 16SrRNA 中药单体
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1株乌鳢水泡病毒的分离与鉴定
2
作者 李园园 袁倩 +4 位作者 冯晓然 邓思 李娜 姚伦广 秦英惠 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期811-822,共12页
[目的]明确2021年9月河南省南阳市某乌鳢养殖场乌鳢大量死亡的病原。[方法]本研究通过体表检测、显微观察、细菌分离、PCR检测、序列相似性和系统进化树分析、细胞培养、透射电镜观察、人工感染及病理切片观察等方法进行病原体鉴定。[结... [目的]明确2021年9月河南省南阳市某乌鳢养殖场乌鳢大量死亡的病原。[方法]本研究通过体表检测、显微观察、细菌分离、PCR检测、序列相似性和系统进化树分析、细胞培养、透射电镜观察、人工感染及病理切片观察等方法进行病原体鉴定。[结果]患病鱼体表无明显机械损伤和出血点,未在患病鱼体表和鳃表面观察到寄生虫的存在,未从患病鱼的组织中分离出致病菌。PCR检测结果显示,患病鱼呈乌鳢水泡病毒(SHVV)阳性。SHVV G基因序列相似性分析显示,分离株与佛山分离株HSHRV-MS2021相似性最高,达99.85%。系统进化树显示,分离毒株与SHVV-2019、SHVV-YL01和HSHRV-MS2021株等聚为同一分支,属于Siniperhavirus属,与HSHRV-MS2021株亲缘关系最近。患病鱼组织匀浆液接种鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papillosum cyprini cells, EPC)和石斑鱼脾脏细胞(grouper spleen cells, GS)均可引起明显的细胞病变。透射电镜观察发现,病变的EPC细胞内存在大量的子弹状病毒粒子。人工感染试验表明,感染鱼出现与自然患病鱼相似症状,死亡率高达100%。组织切片观察显示,回感患病鱼肠道微绒毛消失,肝脏和脾脏血淋巴增多。[结论]本研究从广东以外地区养殖的乌鳢中分离出1株SHVV,命名为SHVV-NY01,该养殖场乌鳢的大量死亡是由SHVV引起的,本研究结果为该病毒的流行病学调查和防控提供了参考。 展开更多
关键词 乌鳢 弹状病毒 乌鳢水泡病毒 分离 鉴定
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稳定表达T7 RNA聚合酶BHK-21细胞株的构建 被引量：2
3
作者 陈宇婧 张艺艺 +5 位作者 黄正阳 石建州 刘阳坤 邱礽 姚伦广 李娜 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第4期1253-1261,共9页
【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PC... 【目的】通过建立过表达T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的慢病毒系统,构建可稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株。【方法】根据GenBank中公布的大肠杆菌BL21(DE3)基因组中T7 RNAP基因序列(登录号:NZ_CP081489.1)设计引物,并采用PCR扩增T7 RNAP基因片段,将其克隆至慢病毒载体中,构建pCDH-CMV-T7 RNAP重组质粒。筛选阳性克隆及测序鉴定后,利用脂质体将包含重组质粒pCDH-CMV-T7 RNAP的包装系统和辅助包装质粒共转染至HEK-293T细胞,进行慢病毒的包装及纯化,获得高病毒滴度的重组慢病毒。将收集的病毒液分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为1、5、10和20感染BHK-21细胞,72 h后观察荧光情况,筛选最佳MOI。将重组慢病毒在最佳MOI条件下感染BHK-21细胞,通过绿色荧光蛋白copGFP的表达观察感染细胞的阳性率。使用4μg/mL嘌呤霉素作为抗性筛选物进行多轮筛选,最终筛选得到BHK-21-T7 RNAP细胞株。进一步对所筛选的细胞株设计3对检测引物进行RT-PCR检测,并通过检测试验组与空白对照组细胞中海肾荧光素酶(hRluc)报告基因的活性差异来反映T7 RNAP驱动T7启动子下游基因的能力。【结果】本研究成功扩增了大肠杆菌BL21(DE3)细胞基因组中T7 RNAP基因,成功构建重组慢病毒载体,并获得了滴度为1.0×10^(8)TU/mL的重组慢病毒。成功筛选到BHK-21-T7 RNAP细胞株,此重组细胞株经RT-PCR扩增能够检测到T7 RNAP的特异性DNA序列。将含有T7启动子驱动的hRluc的质粒(pT7-hRluc)转染此细胞株后发现,BHK-21-T7 RNAP细胞株中hRluc的活力与空白对照组BHK-21细胞相比极显著升高(P<0.01)。【结论】本研究获得了稳定表达T7 RNAP的BHK-21细胞株,且所筛选的BHK-21-T7 RNAP细胞株中的T7 RNAP能够驱动pT7启动子下游基因hRluc的转录,研究结果为RNA病毒的反向遗传学平台建立奠定了细胞基础。 展开更多
关键词 T7 RNA聚合酶 慢病毒载体 细胞株 稳定表达
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猪A组轮状病毒HN2019-01株的分离鉴定及VP6基因序列分析 被引量：2
4
作者 黄正阳 陈宇婧 +4 位作者 黄克 冷超粮 刘阳坤 姚伦广 李娜 《河南农业科学》 北大核心 2021年第6期125-133,共9页
为了解猪轮状病毒(RV)在河南省的流行情况及其分子遗传特征,利用反转录PCR方法,从河南某猪场腹泻样品中扩增得到RV特异性核酸片段,并将腹泻样品利用MA-104细胞进行RV的分离和传代,将分离得到的RV命名为RVA/Pig-wt/HN2019-01。对分离毒株... 为了解猪轮状病毒(RV)在河南省的流行情况及其分子遗传特征,利用反转录PCR方法,从河南某猪场腹泻样品中扩增得到RV特异性核酸片段,并将腹泻样品利用MA-104细胞进行RV的分离和传代,将分离得到的RV命名为RVA/Pig-wt/HN2019-01。对分离毒株VP6基因片段的序列测定及生物信息学分析结果表明,分离毒株VP6核苷酸序列与猪源毒株西南株-1C(SWU-1C)相似性最高,病毒分类上同属I5亚群。VP6蛋白全长397个氨基酸,存在4个N糖基化位点和18个潜在磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋组成,三级空间结构与牛轮状病毒RF株VP6蛋白高度相似,且在2个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位区域的氨基酸序列保守。 展开更多
关键词 轮状病毒 A组轮状病毒 病毒分离 VP6基因 序列分析
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大口黑鲈弹状病毒G蛋白胞外区原核表达及多克隆抗体制备 被引量：2
5
作者 刘海翔 张佩佩 +2 位作者 邓思 秦英惠 姚伦广 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期3762-3770,共9页
【目的】获得能特异性识别大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV双抗夹心法胶体金试纸条的研制提供材料。【方法】根据GenBank上MSRV G蛋白的基因序列(GenBank登录号:OK272491.1)设... 【目的】获得能特异性识别大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV双抗夹心法胶体金试纸条的研制提供材料。【方法】根据GenBank上MSRV G蛋白的基因序列(GenBank登录号:OK272491.1)设计扩增其胞外区的特异性引物,以感染MSRV的GS细胞的cDNA为模板,通过PCR扩增获得目的序列,双酶切后连接至pET-28a(+)表达载体构建重组质粒pET-28a-ΔG,将重组质粒转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞。挑取测序正确的阳性克隆提取重组表达质粒pET-28a-ΔG,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,再次挑取阳性克隆,测序正确后用IPTG诱导表达。目的蛋白经Ni-NTA树脂层析柱纯化后免疫BALB/c雌性小鼠,4次免疫后眼眶采血获得抗MSRV G蛋白的多克隆抗体,最后通过ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR结果显示,获得大小为1 323 bp的目的条带。SDS-PAGE结果显示,构建的重组表达质粒可高效表达目的蛋白,Ni柱纯化后获得单一目的蛋白,分子质量在48.5 ku左右,与预期相符,且纯度符合免疫原要求。ELISA结果显示,制备的多克隆抗体效价为1∶204 800。Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体可特异性识别不同批次的MSRV G蛋白。IFA结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别天然状态下的G蛋白。【结论】本研究利用MSRV G蛋白的胞外区重组蛋白成功制备出能特异性识别MSRV G蛋白的多克隆抗体,为后续MSRV的免疫检测和疫苗开发奠定了基础。 展开更多
关键词 大口黑鲈弹状病毒 G蛋白 原核表达 多克隆抗体
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非洲猪瘟病毒p37蛋白生物信息学分析及其多克隆抗体制备 被引量：1
6
作者 张梦杨 何健 +1 位作者 刘阳坤 姚伦广 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期300-309,共10页
【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号:MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组... 【目的】获取ASFV p37蛋白,并制备抗ASFV p37蛋白的多克隆抗体,为ASFV p37蛋白结构和功能研究提供材料。【方法】应用生物信息学工具对ASFV HLJ/2018(GenBank登录号:MK333180.1)p37蛋白进行分析,设计合成p37基因,并构建pET32a-p37重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE对重组蛋白的可溶性进行分析。收集菌体进行超声破碎,分离沉淀并使用8 mol/L尿素变性后离心,用0.45μm滤膜过滤离心后的上清,使用镍亲和层析柱纯化蛋白,通过SDS-PAGE、Western blotting对其纯化效果及特异性进行验证。将纯化后的p37蛋白按照50μg/只免疫小鼠,制备抗ASFV p37蛋白多克隆抗体。利用间接ELISA方法测定制备的多克隆抗体效价;通过Western blotting、间接免疫荧光试验检测该多克隆抗体的特异性。【结果】生物信息学分析表明,p37蛋白为稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽。二级结构主要含有α-螺旋(45.28%)、延伸链(15.09%)、无规则卷曲(31.54%)。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,经IPTG诱导后,成功表达重组蛋白p37,大小62 ku左右,主要以包涵体形式存在,且能与His单克隆抗体发生反应。间接ELISA结果显示,制备的鼠源多克隆抗体效价为1∶256000。Western blotting结果显示,在42 ku左右出现了特异性条带;间接免疫荧光显示出了特异性的红色荧光,表明该多克隆抗体能与重组杆状病毒表达的p37蛋白发生反应,具有较好的特异性。【结论】本试验成功表达并纯化了ASFV p37蛋白,制备了抗ASFV p37蛋白多克隆抗体,重组蛋白具有较好的免疫原性,能产生较强的免疫反应,为后续ASFV p37蛋白结构功能研究、抗体及相关疫苗研发奠定基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒(ASFV) p37蛋白 蛋白表达 多克隆抗体
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非洲猪瘟病毒pE165R蛋白原核表达及其多克隆抗体制备 被引量：1
7
作者 何健 张梦杨 +1 位作者 刘阳坤 姚伦广 《动物医学进展》 北大核心 2023年第7期10-15,共6页
为进一步深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV),原核表达ASFV pE165R蛋白并制备其多克隆抗体。根据ASFV Pig/HLJ/2018的pE165R基因序列(GenBank:MK333180.1),设计合成pE165R基因,并克隆到pET32a原核表达载体中,构建pET32a-pE165R重组质粒,经双酶... 为进一步深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV),原核表达ASFV pE165R蛋白并制备其多克隆抗体。根据ASFV Pig/HLJ/2018的pE165R基因序列(GenBank:MK333180.1),设计合成pE165R基因,并克隆到pET32a原核表达载体中,构建pET32a-pE165R重组质粒,经双酶切、测序验证后,转化到BL21(DE3)感受态细胞进行表达。通过SDS-PAGE、Western blot进行初步鉴定。将纯化的pE165R蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA、Western blot及间接免疫荧光鉴定多克隆抗体的效价及特异性。结果显示成功表达了ASFV pE165R蛋白,且以可溶性形式大量表达。间接ELISA测得多克隆效价为1∶512000;Western blot结果显示,在21 ku左右处出现了特异性条带,与预期值相符;间接免疫荧光结果显示出了特异性红色荧光,定位于细胞膜上,而对照组未出现红色荧光,表明制备的多克隆抗体能与重组杆状病毒表达的pE165R蛋白发生反应,且具有较好的特异性及反应原性。结果表明,表达、纯化获得了ASFV的pE165R重组蛋白,并成功制备了抗pE165R的多克隆抗体,为进一步研究pE165R蛋白生物学功能、非洲猪瘟疫苗、病毒感染机制等方面提供了物质基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 pE165R蛋白 原核表达 多克隆抗体
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大口黑鲈β-防御素在杆状病毒系统中的表达及抑菌活性
8
作者 管翠翠 邱礽 +2 位作者 李洁琼 蒋长军 姚伦广 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1838-1844,共7页
β-防御素是鱼类天然免疫的重要组成部分,通过杆状表达系统表达大口黑鲈β-防御素,研究其具有高效、广谱的不同于抗生素的独特抗菌的能力。研究通过序列分析,发现大口黑鲈β-防御素(MSBdefe)与其他物种β-防御素具有相似的特征,都包含6... β-防御素是鱼类天然免疫的重要组成部分,通过杆状表达系统表达大口黑鲈β-防御素,研究其具有高效、广谱的不同于抗生素的独特抗菌的能力。研究通过序列分析,发现大口黑鲈β-防御素(MSBdefe)与其他物种β-防御素具有相似的特征,都包含6个保守的半胱氨酸。将MSBdefe基因进行昆虫密码子优化合成后,克隆至穿梭载体pYBDM-IM质粒中,构建成为重组质粒MSBdefe-pYBDM-IM,重组质粒转化感受态细胞MultiBac/rSW106/asd-/inv+,阳性重组菌株MSBdefe-pYBDM-IM-Am直接用于Sf9细胞的感染,获得重组杆状病毒AV-MSBdefe。通过SDS-PAGE和Western Blot检测AV-MSBdefe感染Sf9细胞后蛋白表达,结果表明成功获得MSBdefe重组蛋白。通过对淡水鱼类最常见的病原菌嗜水气单胞菌的抑菌活性分析,结果显示当MSBdefe重组蛋白的终浓度为30μg/mL时,抑菌效率为83.00%,并随着蛋白稀释2倍、4倍后,即终浓度为15和7.5μg/mL时,抑菌效果逐渐减弱,抑菌效率分别为54.33%和33.67%,进而验证了大口黑鲈β-防御素能够抑制嗜水气单胞菌的生长,且随着蛋白浓度的降低抑制能力下降。这些结果为利用昆虫生物反应器规模化生产鱼类β-防御素奠定了基础,以期为开发能够替代或部分替代抗生素的天然抗菌剂提供良好的候选者和技术途径。 展开更多
关键词 Β-防御素 杆状病毒表达系统 抑菌活性 大口黑鲈
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胞内劳森氏菌鞭毛蛋白Flic的可溶性表达与免疫原性分析
9
作者 夏中秋 陈宇婧 +3 位作者 岳凯 管翠翠 杜恩岐 姚伦广 《动物医学进展》 北大核心 2022年第11期22-26,共5页
采用PCR扩增出猪回肠炎胞内劳森氏菌的鞭毛蛋白基因Flic(LI0710),再将目的基因和Msyb标签插入原核表达载体pET-28a,构建表达质粒pET28a-Msyb-Flic。然后将测序正确的质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,0.5 mmol IPTG诱导阳性菌株进行... 采用PCR扩增出猪回肠炎胞内劳森氏菌的鞭毛蛋白基因Flic(LI0710),再将目的基因和Msyb标签插入原核表达载体pET-28a,构建表达质粒pET28a-Msyb-Flic。然后将测序正确的质粒转化至大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,0.5 mmol IPTG诱导阳性菌株进行蛋白表达,采用超声破碎仪破碎菌体收集蛋白。最后使用NI柱摸索纯化条件获得目的蛋白,采用Western blot检测蛋白特异性,免疫小鼠检测抗体水平。结果表明,获得了可溶性表达的胞内劳森氏菌鞭毛蛋白Flic(LI0710),用Flic(LI0710)蛋白免疫小鼠后能产生较高水平的特异性抗体,表达蛋白与小鼠胞内劳森氏菌抗血清可发生特异性反应。结果为胞内劳森氏菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 胞内劳森氏菌 鞭毛蛋白 原核表达 纯化
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