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2021—2022年河南省良凤花种鸡禽白血病病毒感染状况和流行特征
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作者 王汝都 邓祖丽颖 +4 位作者 乔宏兴 张菡 边传周 罗俊 彭志锋 《河南农业科学》 北大核心 2025年第2期138-144,共7页
采用ELISA方法对2021—2022年采自河南省6个市(漯河、驻马店、南阳、新乡、安阳、商丘市)良凤花种鸡的1 342份精液、1 611份泄殖腔拭子、8 187份种蛋和284份胎粪进行ALV-p27(禽白血病病毒-p27)抗原检测,512份母鸡血清进行ALV-A/B和ALV-... 采用ELISA方法对2021—2022年采自河南省6个市(漯河、驻马店、南阳、新乡、安阳、商丘市)良凤花种鸡的1 342份精液、1 611份泄殖腔拭子、8 187份种蛋和284份胎粪进行ALV-p27(禽白血病病毒-p27)抗原检测,512份母鸡血清进行ALV-A/B和ALV-J亚群抗体检测,利用DF-1细胞从雏鸡胎粪中分离ALV,采用PCR扩增分离毒株的gp85基因,并将基因序列与ALV-J亚群不同毒株进行比对和遗传进化分析,为河南省良凤花种鸡禽白血病的防控与净化提供数据支撑。结果表明,精液、泄殖腔拭子、种蛋、胎粪样品中ALV-p27抗原阳性率分别为13.11%(176/1 342)、7.70%(124/1 611)、2.39%(196/8 187)、2.81%(8/284);母鸡血清样品中ALV-A/B和ALV-J抗体阳性率分别为16.60%(85/512)和15.23%(78/512);而且,河南省6个市良凤花种鸡群ALV阳性率差别不大,其中,安阳市最高(4.90%,82/1 675),商丘市最低(3.56%,64/1 798),这表明河南省不同市良凤花种鸡群均有外源性ALV的感染。母鸡泄殖腔拭子、同期所产种蛋、相应雏鸡胎粪的ALV-p27抗原阳性率分别是4.00%(4/100)、1.08%(1/92)、1.15%(1/87),提示雏鸡感染ALV是由垂直传播和水平传播共同造成的,根据种蛋ALV感染情况评估种鸡群中ALV的垂直传播更客观。分离到1株ALV-J毒株HN2022,与参考毒株HLJ09MDJ-1、HuB09-1、SX090912J、CAUHM01和HPRS103在同一进化分支。ALV-J亚群不同毒株gp85基因核苷酸序列同源性和编码氨基酸序列同源性分别为92.7%~97.8%和88.6%~91.8%。gp85基因编码氨基酸序列同源性比对结果显示,分离毒株gp85基因编码氨基酸的变异主要发生在序列高频率变异区Hr 1和Hr 2。综上,试验结果不仅表明河南省良凤花种鸡群中ALV感染比较普遍,而且丰富了ALV遗传变异特性数据,为后续该病毒的研究和该品种鸡禽白血病的净化提供了数据支撑。 展开更多
关键词 良凤花种鸡 禽白血病病毒 P27抗原 病毒分离 流行现状
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猪繁殖与呼吸综合征病毒入侵宿主细胞途径研究进展 被引量:2
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作者 李睿 乔松林 张改平 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第3期80-83,共4页
病毒入侵宿主细胞是其完成自身复制周期的首要步骤。全面解析病毒入侵宿主细胞途径可深入揭示病毒感染及其致病机制,有助于制定更为有效的抗病毒策略。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是具有囊膜的单股正链RNA病毒,对全球养猪业造成巨大... 病毒入侵宿主细胞是其完成自身复制周期的首要步骤。全面解析病毒入侵宿主细胞途径可深入揭示病毒感染及其致病机制,有助于制定更为有效的抗病毒策略。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是具有囊膜的单股正链RNA病毒,对全球养猪业造成巨大的经济损失。以往研究报道PRRSV主要通过网格蛋白介导的内吞途径(CME)入侵宿主细胞。近年来研究发现,除CME外,PRRSV还会采取其他途径入侵宿主细胞。本文通过总结PRRSV入侵宿主细胞途径的最新研究进展,以期加深人们对PRRSV的认识,并为防控该病毒提供新的思路。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 入侵 内吞 巨胞饮 膜融合
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猪肺炎支原体重组蛋白p46真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立
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作者 许世萱 孙亚宁 +5 位作者 邢云瑞 杨苏珍 郭军庆 乔松林 陈鑫鑫 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2025年第6期77-83,共7页
为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被... 为了建立一种猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,构建pCAGGS-P46真核表达载体,转染至HEK293F细胞中进行真核表达,纯化后采用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度及分子质量大小,经Western blot检测重组p46蛋白特异性和反应原性。以重组蛋白p46为包被抗原,优化反应条件,确定阴性、阳性临界值,建立猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法,并对方法的敏感性、稳定性、特异性进行评价。结果显示,p46重组蛋白分子质量大小为48.0 ku,纯度在90%以上,特异性和反应性良好。建立的间接ELISA检测方法最优检测条件为:抗原包被浓度为5μg/mL,采用本实验室封闭液37℃封闭120 min,待检血清1∶50稀释,37℃孵育30 min,二抗稀释度为1∶10000,37℃孵育30 min,TMB室温显色20 min。结果判定标准为:OD 450>0.2887为阳性,OD 450<0.2487为阴性,0.2487≤OD 450≤0.2887为可疑。建立的基于猪肺炎支原体p46蛋白的猪肺炎支原体抗体间接ELISA检测方法具有良好的敏感性、特异性及稳定性,与IDEXX的间接ELISA检测试剂盒检测的阴性、阳性血清符合率分别为100%、93.3%,研究结果为猪肺炎支原体抗体检测和免疫评价提供了技术支持。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 p46蛋白 间接酶联免疫吸附试验
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花生致敏蛋白Ara h 2夹心ELISA检测方法的建立
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作者 郭开通 王耀 +5 位作者 邢云瑞 孙亚宁 宋乾召 葛梦鋆 蔡文锦 胡骁飞 《核农学报》 北大核心 2025年第4期810-816,共7页
为建立花生致敏蛋白Ara h 2双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,本研究基于所制备的抗体,采用双抗体夹心检测模式,以Ara h 2鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,并通过棋盘法优化抗体工作浓度,对该方法的灵... 为建立花生致敏蛋白Ara h 2双抗夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,本研究基于所制备的抗体,采用双抗体夹心检测模式,以Ara h 2鼠源单克隆抗体作为捕获抗体、兔源多克隆抗体作为检测抗体,并通过棋盘法优化抗体工作浓度,对该方法的灵敏度、准确度、精密度和特异性进行鉴定。结果表明,建立的双抗夹心ELISA检测方法对Ara h 2的检出限为5.04 ng·mL^(-1),线性范围为15.63~1 000 ng·mL^(-1),添加回收率为80.12%~96.03%,批内和批间变异系数均小于10%,且特异性良好、与其他常见食物过敏原无交叉反应。本研究可为致敏蛋白Ara h 2检测提供一种快速高效的方法。 展开更多
关键词 酶免疫分析 花生致敏蛋白 Ara h 2 过敏反应 检测
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基于Penton蛋白禽腺病毒血清4型间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量:2
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作者 李鹏 雷梦瑶 +9 位作者 冯丽丽 王振伟 管春晓 郑洪双 王俊茹 王利平 李炎锦 吴欣媛 刘兴友 金前跃 《河南农业科学》 北大核心 2024年第7期133-141,共9页
Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,... Penton蛋白是构成禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)衣壳的主要结构蛋白,具备高度保守性与良好的免疫原性。以纯化的Penton蛋白为包被抗原,建立一种基于禽腺病毒血清4型Penton蛋白的间接ELISA抗体检测方法。结果显示,Penton蛋白最佳包被质量浓度为2μg/mL,血清稀释倍数为200倍,酶标抗体稀释倍数为1∶5000,阳性临界值为0.222,敏感性可达到1∶6400,与鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒均无交叉反应,特异性良好,批间批内重复性变异系数均<10%,在100份临床血清中阳性检出率为77%,与商品化试剂盒检出符合率可达98%。综上,建立的ELISA抗体检测方法可以用于禽腺病毒4型临床抗体检测。 展开更多
关键词 禽腺病毒血清4型 Penton蛋白 间接ELISA 抗体检测
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猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
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作者 王瑞宁 王勋 +4 位作者 李鸽 李青梅 李存法 杨苏珍 郭军庆 《河南农业科学》 北大核心 2024年第12期167-173,共7页
为了开发检测猪伪狂犬病病毒(PRV)的免疫诊断试剂,使用HEK293F细胞表达的gE重组蛋白免疫BALB/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选阳性杂交瘤细胞株,以... 为了开发检测猪伪狂犬病病毒(PRV)的免疫诊断试剂,使用HEK293F细胞表达的gE重组蛋白免疫BALB/c小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)方法筛选阳性杂交瘤细胞株,以期获得对PRV反应性良好的抗gE重组蛋白单克隆抗体。结果显示,获得2株(2B5和8F7)稳定分泌抗PRV gE蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其腹水单克隆抗体的ELISA效价均为1∶1 000000;单克隆抗体亚型鉴定结果表明,2株单克隆抗体的重链均为IgG1亚型,轻链均为Kappa链。单克隆抗体特异性测定结果显示,2株单克隆抗体仅与PRV反应,不与其他常见病毒发生反应;SDS-PAGE结果显示,纯化后的单克隆抗体均在约50 ku和25 ku处有纯度较高的特异性条带;间接免疫荧光试验(IFA)结果表明,制备的2株单克隆抗体与转染gE质粒的293T细胞发生特异性反应。根据Western blot结果,筛选获得的2株单克隆抗体均在120 ku附近出现特异条带,表明这2株单克隆抗体均能特异性识别PRV。综上,成功制备了2株特异性强、效价高的抗gE蛋白单克隆抗体,为后期PRV诊断试剂盒的制备提供重要的生物材料。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 gE蛋白 单克隆抗体 间接免疫荧光试验
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一株马立克病病毒特超强变异株meq基因编辑缺失候选疫苗毒株的构建与鉴定 被引量:1
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作者 张多 滕蔓 +9 位作者 张卓 刘金玲 郑鹿平 各思雨 韩放 罗琴 柴书军 赵东 余祖华 罗俊 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5672-5683,共12页
马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,该病可用疫苗进行预防和控制,但在长期免疫压力下MDV的毒力持续增强,经典MD疫苗已难以对当前流行的特超强MDV(HV-MDV)变异株提供良好的免疫保护,亟需研... 马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,该病可用疫苗进行预防和控制,但在长期免疫压力下MDV的毒力持续增强,经典MD疫苗已难以对当前流行的特超强MDV(HV-MDV)变异株提供良好的免疫保护,亟需研发新一代MD高效疫苗。本文以HV-MDV变异株HNSQ01为亲本毒株,在CEF上连续传代之后,利用CRISPR/Cas9系统对其meq基因进行编辑,通过一系列试验鉴定和分析,最终建立一株meq基因编辑缺失的MD疫苗候选毒株,命名为SQ01Δmeq。1日龄SPF鸡攻毒试验结果显示,在77 d试验周期内,亲本毒株HNSQ01不仅严重抑制感染鸡生长并导致免疫抑制,而且导致100%的MD发病率、100%致死率及80%的肉眼观察肿瘤发生率;但SQ01Δmeq未引起感染鸡的生长及免疫抑制,而且MD发病率、致死率及肿瘤发生率均为0%,表明其对宿主无致病性,生物安全性良好。本研究建立的meq基因编辑缺失MDV毒株SQ01Δmeq,为后续研发新型高效的MD疫苗奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病 MDV MEQ CRISPR/Cas9 基因编辑 基因缺失 新型疫苗
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基于二聚体核衣壳蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体iELISA检测方法建立 被引量:1
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作者 赵啸 乔松林 +3 位作者 孙亚宁 钱祁昇 李睿 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第11期135-146,共12页
为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N),设计表达二聚体N蛋白(N-dimer),并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体间接酶联免疫吸附试验... 为制备稳定性好、免疫反应性佳的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,N),设计表达二聚体N蛋白(N-dimer),并基于该蛋白质建立猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)抗体间接酶联免疫吸附试验(Indirect enzyme-linked immunosorbent assay,iELISA)检测方法。首先选取当前PRRSV国内优势毒株NADC30-like N蛋白基因序列,通过(GGGGS)3linker将N蛋白基因序列串联,经密码子优化合成后构建N-dimer重组表达载体。利用原核表达系统进行诱导表达,并通过镍离子螯合亲和层析法进行纯化。Western-blot分析其与PRRSV阳性和阴性血清的反应性;冻融法比较N-dimer与单体N蛋白(N-monomer)的沉淀析出情况;ELISA法比较N-dimer与N-monomer的免疫反应性。以N-dimer作为包被抗原建立PRRSV抗体iELISA检测方法,对该方法的反应条件进行优化,验证其特异性、敏感性、重复性,并应用于临床血清样品检测。结果表明,在16℃、0.2 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷条件下诱导16 h,N-dimer获得大量可溶性表达。Western-blot结果表明,N-dimer能够与PRRSV阳性血清发生特异性反应;相较于N-monomer,N-dimer能够稳定保存,并且免疫反应性更佳。成功建立了基于N-dimer的PRRSV抗体iELISA检测方法,且该方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性;与商业试剂盒结果进行比较,其阳性符合率为96.88%,总符合率为96.86%,符合率高。综上,成功制备了稳定性好、免疫反应性佳的N-dimer,并基于N-dimer建立了PRRSV抗体iELISA检测方法。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 核衣壳蛋白 二聚体 间接ELISA 临床检测
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一种通用型半抗原免疫层析试纸的制备及在双咪苯脲上的应用
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作者 邢云瑞 孙亚宁 +3 位作者 胡骁飞 范璐 陈琳琳 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第9期117-125,共9页
为了提高单克隆抗体筛选效率,降低免疫层析检测方法建立门槛,利用生物素标记人工抗原为探针,以亲和素固定于硝酸纤维素膜上为检测线,建立了通用型半抗原免疫层析试纸,并将其应用于双咪苯脲(IM)单克隆抗体的筛选及残留检测。结果表明,利... 为了提高单克隆抗体筛选效率,降低免疫层析检测方法建立门槛,利用生物素标记人工抗原为探针,以亲和素固定于硝酸纤维素膜上为检测线,建立了通用型半抗原免疫层析试纸,并将其应用于双咪苯脲(IM)单克隆抗体的筛选及残留检测。结果表明,利用碳二亚胺法成功制备了IM人工抗原及生物素探针;通过免疫小鼠及杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体;应用试纸筛选,成功获得IM单克隆抗体细胞株1株,其效价为1∶32000,灵敏度为6.25 ng/mL。基于该单抗及通用型半抗原免疫层析试纸建立了IM免疫层析检测试纸,检测牛奶中IM的灵敏度为7 ng/mL。该试纸及其探针制备方法可以通用于半抗原抗体筛选,为抗体筛选提供了一种更高效的方法;无需免疫层析试纸研发平台即可建立半抗原免疫层析检测方法,为免疫层析试纸的研发提供了新的技术手段。 展开更多
关键词 半抗原 通用型免疫层析试纸 双咪苯脲 抗体筛选 残留检测
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