猪瘟病毒E2蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫原性分析 被引量：4

1

作者 王冬雨 魏蔷 +4 位作者 刘运超 刘畅 杨棋 崔颖磊 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第3期128-133,143,共7页

为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,在大肠杆菌中表达E2蛋白,并对其进行纯化及免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western ... 为制备具有免疫原性的猪瘟病毒E2蛋白,在大肠杆菌中表达E2蛋白,并对其进行纯化及免疫原性分析。将E2基因插入原核表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-28a-E2,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性E2蛋白。对IPTG浓度及诱导温度和时间进行优化,结果显示,IPTG终浓度为0.1 mmol/L时,18℃条件下诱导表达16 h,E2蛋白的可溶性表达量最高。通过分子筛一步纯化E2蛋白,其终质量浓度为0.5 g/L。Western blot分析和间接ELISA结果显示,纯化后的E2蛋白在变性及非变性条件下都能够被猪瘟阳性血清特异性识别,表明纯化后的E2蛋白活性良好。将纯化后的E2蛋白添加弗氏佐剂乳化后免疫BALB/C小鼠,采集血清进行病毒中和试验,结果显示,免疫后56 d产生较高水平的中和抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。综上,成功利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达了可溶性E2蛋白,且纯化后的E2蛋白免疫原性良好。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 蛋白质纯化 血清学分析 免疫原性

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猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究 被引量：1

2

作者 周稳 金前跃 +9 位作者 陈晓 丁培阳 李旭峰 王垚 柴永笑 张雨航 周恩民 郭军庆 郅玉宝 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2020年第1期1-7,共7页

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪... 猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 毕赤酵母 蛋白纯化 免疫活性

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传染性法氏囊病毒VP2蛋白的高效表达与免疫原性分析 被引量：2

3

作者 杨棋 魏蔷 +4 位作者 刘运超 冯华 蒋大伟 陈玉梅 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第5期124-128,共5页

为了实现传染性法氏囊病毒(IBDV)B87毒株VP2蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,将IBDV B87毒株VP2基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒p ET28a-VP2,将其转化不同大肠杆菌基因工程菌株,通过IPTG诱导表达VP2外源蛋白。利用鸡传... 为了实现传染性法氏囊病毒(IBDV)B87毒株VP2蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,将IBDV B87毒株VP2基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒p ET28a-VP2,将其转化不同大肠杆菌基因工程菌株,通过IPTG诱导表达VP2外源蛋白。利用鸡传染性法氏囊病抗原快速检测试纸筛选,确定了BL21(DE3)为VP2可溶性蛋白的高效表达菌株。SDS-PAGE、Western blot分析表明,VP2实现了可溶性表达,且可溶性VP2蛋白具有良好的反应原性。将表达的重组蛋白利用琼脂扩散试验(AGP)分析,结果表明,VP2蛋白的AGP效价达到1∶64。将重组蛋白免疫接种SPF鸡,制备的抗血清AGP效价可达1∶16,说明表达的B87毒株VP2蛋白免疫原性良好。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病毒 B87毒株 VP2蛋白 原核表达 免疫原性

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鸡减蛋综合征病毒中和性单克隆抗体的制备、鉴定及在双抗体夹心ELISA中的应用 被引量：1

4

作者 魏蔷 李青梅 +3 位作者 金前跃 宋亚鹏 白怡霖 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2024年第2期128-135,共8页

为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iE... 为了制备针对鸡减蛋综合征病毒(EDSV)的中和性单克隆抗体,首先纯化得到重组EDSV纤维蛋白,经血凝试验(HA)鉴定纤维蛋白的血凝活性,HA效价为1∶2~7。之后将纤维蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,免疫4次后,小鼠血清的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)效价最高达到1∶409 600,间接免疫荧光试验(IFA)效价最高达到1∶12 800。取效价最高免疫小鼠脾细胞进行细胞融合制备杂交瘤细胞,结合iELISA和IFA检测,经过多轮亚克隆,最终成功获得了2株稳定分泌中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株9G12和10E11。iELISA结果显示,单克隆抗体9G12和10E11的腹水效价分别为1∶128 000和1∶1 020 000;IFA效价分别为1∶2 000和1∶8 000。Western blot检测结果显示,单克隆抗体9G12和10E11均不能识别变性的EDSV纤维蛋白,表明二者识别纤维蛋白的构象型表位。病毒中和试验结果表明,单克隆抗体9G12和10E11均具有中和活性,中和效价分别为1∶2~7和1∶2~4。亚型鉴定表明,这2种单克隆抗体的轻链均为Kappa型,重链均为IgG1亚型。将基于单克隆抗体9G12和10E11建立的双抗体夹心ELISA方法应用于临床检测EDSV抗原,与荧光定量PCR检测结果的符合率为91.7%。综上,成功筛选出9G12和10E11杂交瘤细胞株,二者分泌抗EDSV特异性抗体,且这2种抗体具有中和EDSV感染活性,可应用于EDSV的临床检测。 展开更多

关键词 减蛋综合征病毒 纤维蛋白 中和性单克隆抗体 抗体中和效价 双抗体夹心ELISA

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猪流行性乙型脑炎弱毒活疫苗的效价测定及保存稳定性研究 被引量：4

5

作者 滕蔓 罗俊 +5 位作者 樊剑鸣 禹乐乐 胡博 李秀杰 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2015年第2期119-122,131,共5页

为评估市售商品化猪乙型脑炎(JE)弱毒活疫苗的质量以及实验室条件下疫苗的保存稳定性,采用TCID50效价测定和RT-PCR检测病毒的保守基因(E基因和C/pr M基因)2种方法对2012年市场销售的主要国产疫苗产品进行了质量评估,同时将供试疫苗产品... 为评估市售商品化猪乙型脑炎(JE)弱毒活疫苗的质量以及实验室条件下疫苗的保存稳定性,采用TCID50效价测定和RT-PCR检测病毒的保守基因(E基因和C/pr M基因)2种方法对2012年市场销售的主要国产疫苗产品进行了质量评估,同时将供试疫苗产品置-30℃保存3、6、9、12个月后分别取样测定乙脑病毒(JEV)TCID50效价。结果表明,市售的猪乙脑同类疫苗中不同品牌产品之间活病毒含量差异较大,最高可达104.33TCID50/头份,但部分产品含量极低,甚至难以检测到活病毒;E基因和C/pr M基因的RT-PCR扩增产物丰度的差异与TCID50测定结果基本一致。多数疫苗产品在有效期内病毒效价基本稳定,同一厂家生产的疫苗保存期越短,其中相对活病毒越多,效价越高。 展开更多

关键词 猪 乙型脑炎 疫苗 TCID50 RT-PCR

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猪乙脑病毒BHK-21细胞传代株BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60的全基因组序列分析

6

作者 滕蔓 胡博 +5 位作者 冯丽丽 樊剑鸣 郅玉宝 李秀杰 邓瑞广 罗俊 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2016年第3期135-140,共6页

为研究猪源乙脑病毒分离株基因遗传稳定性,对猪源乙脑病毒分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上连续传代60次后的病毒全基因组进行序列测定及分析。结果表明,BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60基因组全长均与各自的亲本毒株BSF.ZZ-1、BSF.Z... 为研究猪源乙脑病毒分离株基因遗传稳定性,对猪源乙脑病毒分离株BSF.ZZ-1和BSF.ZZ-3在BHK-21细胞上连续传代60次后的病毒全基因组进行序列测定及分析。结果表明,BSF.ZZ-1-p60、BSF.ZZ-3-p60基因组全长均与各自的亲本毒株BSF.ZZ-1、BSF.ZZ-3一致,均为10 977 nt,在2个病毒基因组的10 701 nt位点处均插入1个碱基G。与亲本毒株相比,2个细胞传代毒株的病毒基因组经连续传代后趋于稳定,均有10个位点发生氨基酸突变,这些突变主要集中在E蛋白区域。核苷酸序列同源性比对分析发现,与其他JEV参考毒株相比,BSF.ZZ-1-p60和BSF.ZZ-3-p60与弱毒疫苗株SA14-14-2的核苷酸序列同源性较高,分别为99.6%和95.9%,其氨基酸序列与猪源野毒分离株SH0601和HW的氨基酸序列同源性较高,分别为98.2%、86.4%和98.3%、86.5%。 展开更多

关键词 猪 乙脑病毒 BHK-21细胞 细胞传代 病毒基因组 序列分析

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狂犬病病毒G蛋白的原核表达及反应原性分析 被引量：5

7

作者 王攀 刘运超 +3 位作者 魏蔷 柴书军 陈玉梅 张改平 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2017年第4期108-112,共5页

为优化狂犬病病毒G蛋白的原核表达条件,探究其反应原性,参照狂犬病病毒CTN-1V10株编码G蛋白基因序列,采用生物工程合成的方法合成编码G蛋白的基因片段,并将该片段命名为G5F。将该片段与pET-28a原核表达载体连接,构建重组表达质粒pET-G5F... 为优化狂犬病病毒G蛋白的原核表达条件,探究其反应原性,参照狂犬病病毒CTN-1V10株编码G蛋白基因序列,采用生物工程合成的方法合成编码G蛋白的基因片段,并将该片段命名为G5F。将该片段与pET-28a原核表达载体连接,构建重组表达质粒pET-G5F,并将重组质粒进行诱导表达,在IPTG浓度为0.2 mmol/L、温度为20℃、诱导12 h时,重组蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳及Western blot分析表明,G5F重组蛋白可溶性表达量高,且可以被抗狂犬病病毒单克隆抗体识别,反应原性良好。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 G蛋白 可溶性表达 反应原性

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信号肽对猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中分泌表达的影响 被引量：6

8

作者 魏蔷 刘运超 +3 位作者 白怡霖 冯华 宋亚鹏 张改平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期120-127,共8页

旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽(简称endo)、蜂素信号肽(简称mel)及gp67信号肽(简称gp67)分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10... 旨在通过引入信号肽序列实现猪瘟病毒E2蛋白在杆状病毒表达系统中的高效表达。首先将内源信号肽(简称endo)、蜂素信号肽(简称mel)及gp67信号肽(简称gp67)分别引入pFastBac1载体,随后插入E2基因,构建重组质粒。随后将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选得到重组黏粒,将重组黏粒转染sf21细胞以得到杆状病毒。经扩增后大量感染细胞,检测E2蛋白表达情况,利用镍填料纯化得到E2蛋白,并进行蛋白糖基化水平鉴定及蛋白免疫原性分析。PCR鉴定结果显示成功构建了重组质粒。挑选白斑进行PCR鉴定,证实得到重组黏粒。Western blot检测结果表明,E2蛋白实现了分泌表达,进一步比较细胞培养上清中E2蛋白的表达水平,确定gp67信号肽介导的E2蛋白分泌表达量最高。经镍填料纯化得到E2蛋白,SDS-PAGE结果显示其纯度较高,产率为25 mg·L^-1。通过ELISA分析其抗原性,结果表明纯化所得E2蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清中的抗体,其抗原性良好。将纯化后的E2蛋白添加ISA201佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠,阻断ELISA结果显示,免疫后14 d即产生较高水平的猪瘟特异性抗体,表明E2蛋白免疫原性良好。本研究为E2亚单位疫苗的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 信号肽 E2蛋白 猪瘟病毒(CSFV) 分泌表达

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温度敏感型可注射水凝胶的性质及应用研究进展 被引量：8

9

作者 任婷婷 卢清侠 +2 位作者 郝慧芳 邓瑞广 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2018年第1期99-103,共5页

温度敏感型可注射水凝胶是一种对温度敏感的新型材料,可以随着温度的变化发生物理状态的变化。由于这种特性,该水凝胶材料近年来被广泛的应用于疫苗和药物控释以及组织支架工程等领域。温度敏感型可注射水凝胶材料根据其结构的不同大致... 温度敏感型可注射水凝胶是一种对温度敏感的新型材料,可以随着温度的变化发生物理状态的变化。由于这种特性,该水凝胶材料近年来被广泛的应用于疫苗和药物控释以及组织支架工程等领域。温度敏感型可注射水凝胶材料根据其结构的不同大致可分为5个种类,论文对这5种材料的温变机制、生物相容性、毒性、可降解性等性质进行了综述,阐述了每种材料的特点,并对各个材料在药物疫苗传递系统和组织支架工程两方面的应用研究进展分别进行了归纳和总结,为温度敏感型可注射水凝胶在人类和动物医学领域的应用提供科学依据,并对其未来发展前景进行展望。 展开更多

关键词 温度敏感型水凝胶 可注射水凝胶 疫苗控释 药物控释 生物医用材料

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猪圆环病毒2b型表位嵌合病毒样颗粒在E.coli中的制备及鉴定 被引量：1

10

作者 冯华 刘晴坤 +2 位作者 任春晓 刘运超 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2020年第6期137-142,共6页

为了研究一种更为高效、廉价的猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗,针对PCV2b型Cap基因核酸序列进行优化,将其编码中和表位226LKDPPLNP233的基因序列连接于Cap基因C端(Capc),并插入PE-Sumo载体,借助大肠杆菌表达系统对Capc蛋白进行表达;利用... 为了研究一种更为高效、廉价的猪圆环病毒2型(PCV2)亚单位疫苗,针对PCV2b型Cap基因核酸序列进行优化,将其编码中和表位226LKDPPLNP233的基因序列连接于Cap基因C端(Capc),并插入PE-Sumo载体,借助大肠杆菌表达系统对Capc蛋白进行表达;利用SDS-PAGE、Western blot、动态光散射和透射电镜观察等手段,对纯化后的目的蛋白活性及其形成的结构进行初步鉴定。结果显示,嵌合Capc基因片段成功插入PE-Sumo载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中;Sumo-Capc重组蛋白在26℃下诱导12 h能够以可溶形式大量表达;经纯化的Capc蛋白能够与PCV2单克隆抗体特异结合,并能够自组装形成直径约为18 nm的病毒样颗粒。综上,成功构建了能够表达PCV2b型中和表位嵌合Cap的大肠杆菌表达系统,纯化得到的Capc蛋白具有良好的免疫反应性,且能够自组装成病毒样颗粒。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 中和表位 CAP蛋白 病毒样颗粒 候选疫苗

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猪瘟病毒Erns蛋白在杆状病毒表达系统中的分泌表达及活性检测 被引量：1

11

作者 魏蔷 白怡霖 +3 位作者 柴书军 刘运超 宋亚鹏 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2020年第2期136-141,共6页

为制备用于ELISA检测猪瘟病毒的E^rns蛋白,根据昆虫细胞密码子偏好性对E^rns的基因序列进行优化,将优化后的E^rns基因插入带有信号肽的表达载体pFastBacl-gp67中;随后将重组质粒pFastBacl-gp67-E^rns转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛... 为制备用于ELISA检测猪瘟病毒的E^rns蛋白,根据昆虫细胞密码子偏好性对E^rns的基因序列进行优化,将优化后的E^rns基因插入带有信号肽的表达载体pFastBacl-gp67中;随后将重组质粒pFastBacl-gp67-E^rns转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑选白斑,提取重组黏粒Bacmid-E^rns;将重组黏粒转染sf21细胞得到杆状病毒,经扩增后得到P 3病毒,利用其大量感染细胞,3 d后收取细胞培养上清;通过镍填料纯化得到分泌表达的E^rns蛋白,通过SDS-PAGE及Western blot检测分泌蛋白的表达水平、纯化情况,用PNGase F处理分析其糖基化水平,通过ELISA分析其抗原性。结果显示,成功构建了重组质粒pFastBacl-gp67-E^rns,蓝白斑筛选获得了重组黏粒Bacmid-E^rns,在此基础上获得了重组杆状病毒,利用其感染sf21细胞,成功分泌表达了E^rns蛋白,纯化所得E^rns蛋白纯度较高,具有较高糖基化修饰水平,且纯化所得E^rns蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清,其抗原性良好。 展开更多

关键词 猪瘟病毒 E^rns蛋白 分泌表达 糖基化分析 活性 杆状病毒

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猪圆环病毒2型主要蛋白编码序列的密码子偏性分析 被引量：1

12

作者 冯华 刘运超 +2 位作者 李青梅 金前跃 张改平 《动物医学进展》 北大核心 2022年第5期36-41,共6页

为进一步了解猪圆环病毒2型(PCV2)分子进化特点,以PCV2主要蛋白编码序列ORF1和ORF2为研究对象,对74株不同亚型(2a-2e)PCV2进行核酸组成、相对同义密码子使用频率(RSCU)、有效密码子数目(ENC)、中性绘图和密码自适应指数等生物信息学分析... 为进一步了解猪圆环病毒2型(PCV2)分子进化特点,以PCV2主要蛋白编码序列ORF1和ORF2为研究对象,对74株不同亚型(2a-2e)PCV2进行核酸组成、相对同义密码子使用频率(RSCU)、有效密码子数目(ENC)、中性绘图和密码自适应指数等生物信息学分析,以了解PCV2密码子使用模式及其影响因素。结果显示,相比AU含量,PCV2 GC含量较低(低于50%),但更倾向于使用以C和U结尾的密码子;RSCU值和对应分析显示在密码子使用上,各亚型PCV2间差异较小,但PCV2各亚型与寄主Sus.s间则存在较大的差异;ENC分析和中性分析显示,相比突变压力,各亚型PCV2密码子使用模式受到较大程度的自然选择的影响;CAI值分析结果进一步确定,相比PCV2c和PCV2e,PCV2a、2b和2d在密码子使用上更适应其寄主。论文揭示了自然选择是影响PCV2密码子使用模式的重要因素,并分析了影响各PCV2亚型流行的因素,该结果有助于PCV2分子进化的研究和理解该病毒在其寄主内翻译的机制。 展开更多

关键词 猪圆环病毒2型 亚型 基因 密码子 密码子偏性

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