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家禽疱疹病毒CRISPR/Cas9基因编辑最新研究进展 被引量：5
1
作者 罗俊 刘金玲 +2 位作者 郑鹿平 罗琴 滕蔓 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期3335-3344,共10页
基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑是最新一代的基因组编辑技术,在向导RNA(gRNA)的介导下几乎可以靶向编辑任何一种基因,实现基因组的定点突变、敲除或插入。近年来将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大基因组DNA病毒的研究,尤其是用于疱疹... 基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑是最新一代的基因组编辑技术,在向导RNA(gRNA)的介导下几乎可以靶向编辑任何一种基因,实现基因组的定点突变、敲除或插入。近年来将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大基因组DNA病毒的研究,尤其是用于疱疹病毒的基因编辑已成为病毒学研究领域的最新国际热点。自2016年首次报道利用CRISPR/Cas9系统改造家禽疱疹病毒如马立克病病毒(MDV)基因组以来,短短5年时间已全面应用于家禽疱疹病毒的蛋白编码基因和非编码RNA基因的编辑、基因缺失疫苗和重组疫苗研发、抗病毒治疗以及抗病育种等领域。本文详细综述了当前CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽疱疹病毒中的应用进展和最新成果,并对其面临的问题和前景进行了展望,以期为后续研究提供重要参考。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 基因编辑 家禽疱疹病毒
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禽腺病毒血清4型Fiber2 Head蛋白表达及其单克隆抗体筛选
2
作者 朱荣芳 金前跃 +10 位作者 柴永笑 陈晓 李伟 郭振华 卢清侠 柴书军 邢云瑞 季辉 吕凤霞 邢广旭 张改平 《中国动物传染病学报》 北大核心 2024年第6期135-144,共10页
为制备抗禽腺病毒血清4型(FAdV4)Fiber2 Head蛋白的特异性单克隆抗体(mAb),本研究将纤突蛋白(Fiber2)截短,并利用大肠杆菌系统进行原核表达。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过间接ELISA及免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛... 为制备抗禽腺病毒血清4型(FAdV4)Fiber2 Head蛋白的特异性单克隆抗体(mAb),本研究将纤突蛋白(Fiber2)截短,并利用大肠杆菌系统进行原核表达。将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过间接ELISA及免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行反应性测定、效价测定以及亚型鉴定。结果显示:Fiber2 Head蛋白在大肠杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,成功获得8株单克隆细胞株分别命名为5A5、1D5、7C9、4E5、3A11、5E11、9D7、6E3,均可分泌特异性识别Fiber2 Head蛋白及FAdV4的单克隆抗体。综上,本研究成功制备了能与Fiber2 Head蛋白和FAdV4病毒特异性反应的单克隆抗体,为FAdV4抗原和抗体检测试剂的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 禽腺病毒4型 Fiber2蛋白 单克隆抗体 免疫检测
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禽腺病毒血清4型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用 被引量：6
3
作者 卢清侠 金前跃 +4 位作者 冯丽丽 柴永笑 郭振华 邢广旭 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2022年第12期131-138,共8页
为建立禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV4)临床检测方法,根据GenBank中该病毒Hexon基因序列设计扩增引物,将扩增的Hexon基因连接至pEASY-Blunt载体,构建重组质粒pEASY-Blunt-Hexon,同时对Hexon基因进行分析,选取高度保... 为建立禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV4)临床检测方法,根据GenBank中该病毒Hexon基因序列设计扩增引物,将扩增的Hexon基因连接至pEASY-Blunt载体,构建重组质粒pEASY-Blunt-Hexon,同时对Hexon基因进行分析,选取高度保守区域,设计荧光定量检测引物,建立FAdV4 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法扩增产物长度为95 bp,最低检测下限为7.1×102拷贝/μL,且与其他禽源病毒无交叉反应,批内和批间重复性试验变异系数均不超过2%,具有良好的特异性和重复性。将建立的检测方法应用于检测FAdV4在鸡肝癌细胞(Leghorn male hepatocellular cells,LMH)上的增殖特性,并与TCID50法测定的病毒滴度进行比较,结果显示,2种检测方法具有良好的相关性。综上,本研究建立的检测方法可用于FAdV4的临床早期快速检测。 展开更多
关键词 禽腺病毒血清4型 Hexon基因 荧光定量PCR 检测
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禽腺病毒4型ZZ株的分离鉴定及系统进化分析 被引量：5
4
作者 金前跃 王寅彪 +6 位作者 柴永笑 卢清侠 李鹏 郭振华 邢广旭 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2020年第11期128-133,共6页
为深入研究禽腺病毒4型(FAdV-4)河南流行株的基因组特征和分子进化关系,从患有心包积水综合征的病鸡样品中分离了1株FAdV-4(FAdV-4 ZZ),并对分离毒株进行了全基因组序列分析和分子进化分析。结果表明,FAdV-4 ZZ株可在鸡肝癌细胞上稳定... 为深入研究禽腺病毒4型(FAdV-4)河南流行株的基因组特征和分子进化关系,从患有心包积水综合征的病鸡样品中分离了1株FAdV-4(FAdV-4 ZZ),并对分离毒株进行了全基因组序列分析和分子进化分析。结果表明,FAdV-4 ZZ株可在鸡肝癌细胞上稳定传代并产生明显的细胞病变。与无毒力的FAdV-4 ON1株和FAdV-4 KR5株相比,FAdV-4 ZZ株以及国内流行的CH/JSXZ/2015、JSJ13、SDSX1株均存在ORF19、ORF27、ORF30基因缺失。与国内首次分离的JSJ13株相比,FAdV-4 ZZ株的ORF29序列存在33个碱基缺失。FAdV-4 ZZ株的Hexon基因与国内流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列相似性均为100%,与ON1株和KR5株的Hexon基因核苷酸序列相似性分别为98.69%和98.90%。综上,成功分离了FAdV-4 ZZ株,并获得了分离毒株的全基因组序列及其与国内外相关毒株的分子进化关系。 展开更多
关键词 禽腺病毒 血清4型 分离鉴定 全基因组 系统进化分析
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鹅星状病毒XX株的分离鉴定及遗传特征分析 被引量：8
5
作者 金前跃 郭永刚 +7 位作者 李俊朋 秦保亮 王寅彪 郭振华 王丽 邢广旭 邓瑞广 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2021年第6期134-141,共8页
为研究引起雏鹅痛风疫情的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)河南流行株的基因组特征,从患有痛风的雏鹅样品中分离了1株GAstV,命名为XX株,并对分离毒株进行了全基因组测序和遗传特征分析。结果显示,GAstV XX株可在LMH细胞上稳定传代,... 为研究引起雏鹅痛风疫情的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)河南流行株的基因组特征,从患有痛风的雏鹅样品中分离了1株GAstV,命名为XX株,并对分离毒株进行了全基因组测序和遗传特征分析。结果显示,GAstV XX株可在LMH细胞上稳定传代,但无明显的细胞病变;该毒株基因组全长7252 bp,与代表性毒株GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01的基因组核苷酸序列同源性分别为98.1%、98.7%、98.7%。系统进化分析结果显示,GAstV XX株与GD、AstV/SDPY/Goose/1116/17、AAstV/Goose/CHN/2017/SD01等毒株处于同一进化分支,属于禽星状病毒1群。ORF2编码蛋白氨基酸序列分析结果显示,与已报道的GAstV流行毒株相比,GAstV XX株存在多个氨基酸位点的突变。 展开更多
关键词 鹅星状病毒 分离鉴定 全基因组测序 遗传特征 同源性 系统进化分析
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miR-M11基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响 被引量：5
6
作者 王伟东 滕蔓 +6 位作者 郑鹿平 刘金玲 张文凯 李林燕 张志会 樊剑鸣 罗俊 《河南农业科学》 北大核心 2023年第1期134-143,共10页
为探究病毒编码的微小RNA前体基因miR-M11对马立克病病毒(MDV)体外复制能力的影响,以MDV国内分离株HN_(3)0_(2)为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑并敲除位于Mid基因簇的miRM11,构建1株miR-M11基因编辑缺失毒株HN_(3)0_(2)ΔM11(... 为探究病毒编码的微小RNA前体基因miR-M11对马立克病病毒(MDV)体外复制能力的影响,以MDV国内分离株HN_(3)0_(2)为研究对象,利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑并敲除位于Mid基因簇的miRM11,构建1株miR-M11基因编辑缺失毒株HN_(3)0_(2)ΔM11(克隆号C58-8-4)。经过PCR鉴定、测序分析、间接免疫荧光试验(IFA)、实时荧光定量PCR(qPCR)以及传代稳定性分析,证实HN302编码的miRM11被精确编辑并从病毒基因组中完全缺失,且未发生回复突变。病毒增殖曲线绘制结果显示,miRM11缺失毒株HN_(3)0_(2)ΔM11的增殖速度显著高于亲本毒株HN_(3)0_(2)(P<0.05)。综上,miR-M11是MDV复制的非必需基因,且其缺失后可增强MDV的体外复制能力。 展开更多
关键词 马立克病 miR-M11 微小RNA CRISPR/Cas9 基因编辑 qPCR 复制
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2020-2021年市售马立克病疫苗的效价测定及质量评估 被引量：2
7
作者 郑鹿平 滕蔓 +5 位作者 刘金玲 罗琴 楚钰淑 王伟东 张文凯 罗俊 《河南农业科学》 北大核心 2022年第6期134-143,共10页
为了解和评估现有鸡马立克病(MD)疫苗的质量,采用间接免疫荧光试验(IFA)对2020—2021年市场销售的9家不同企业生产的11个批次MD疫苗产品进行病毒效价测定和对比分析,同时用ELISA试剂盒、胶体金试纸条或RT-PCR方法分别对禽白血病病毒(ALV... 为了解和评估现有鸡马立克病(MD)疫苗的质量,采用间接免疫荧光试验(IFA)对2020—2021年市场销售的9家不同企业生产的11个批次MD疫苗产品进行病毒效价测定和对比分析,同时用ELISA试剂盒、胶体金试纸条或RT-PCR方法分别对禽白血病病毒(ALV)和禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的污染状况进行检测。结果表明,在所检测的MD液氮苗中,3批进口或国产的CVI988单价液氮苗之间病毒效价无显著差异,2批不同品牌814单价液氮苗效价差异显著(P<0.05),2批不同品牌双价液氮苗(CVI988+HVT或814+HVT)病毒效价差异极显著(P<0.01),但上述全部类型液氮苗产品的病毒效价均大于5 500 PFU/羽份,达到国标规定值2倍以上。然而,4批不同品牌HVT冻干苗的病毒效价均远低于产品说明书标注的2 000 PFU/羽份,仅为83.90~109.50 PFU/羽份。全部MD疫苗产品的ALV和REV检测结果均为阴性,表明这些产品洁净无污染。 展开更多
关键词 马立克病 疫苗 效价测定 间接免疫荧光试验 禽白血病病毒 禽网状内皮组织增生症病毒
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马立克病病毒单克隆抗体库构建及gB蛋白特异性单抗的筛选与鉴定
8
作者 李林燕 滕蔓 +5 位作者 刘金玲 郑鹿平 柴书军 丁轲 余祖华 罗俊 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4712-4723,共12页
马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的危害最严重的一种家禽免疫抑制病与肿瘤病,制备MDV单克隆抗体可为后续的基因功能、致病机制及诊断技术研究提供关键试剂。本研究利用NE-PER TM细胞核和细胞质提取试剂,分别制备了vvMDV(MDV... 马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的危害最严重的一种家禽免疫抑制病与肿瘤病,制备MDV单克隆抗体可为后续的基因功能、致病机制及诊断技术研究提供关键试剂。本研究利用NE-PER TM细胞核和细胞质提取试剂,分别制备了vvMDV(MDV超强毒株)标准毒株Md5感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)核蛋白和浆蛋白,通过切向流超滤浓缩后制备免疫原,分别免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,常规细胞融合方法制备单克隆抗体杂交瘤细胞。通过间接免疫荧光试验(IFA)筛选,建立了一个容量为31株纯化的MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库,包括27株稳定分泌MDV-1特异性抗体和4株稳定分泌MDV-1、MDV-2和火鸡疱疹病毒(HVT)保守抗体的杂交瘤细胞株。经过293T细胞真核表达gB蛋白并结合IFA染色,其中1株单克隆抗体J-1F3-C6被鉴定为MDV糖蛋白gB的特异性单克隆抗体,其单抗腹水IFA效价为1∶25600,轻链型为Kappa,IgG亚型为IgG2a。进一步IFA染色表明,J-1F3-C6可特异性识别MDV-1、MDV-2和HVT毒株表达的gB蛋白,但在蛋白质免疫印迹(Western blot)分析中J-1F3-C6只与MDV-1和HVT发生特异性反应。综上,本研究建立了一个MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库,并从中筛选鉴定了1株gB蛋白特异性的单克隆抗体,为后续研究奠定了重要基础。 展开更多
关键词 马立克病 单克隆抗体 糖蛋白gB 间接免疫荧光试验 共聚焦分析 蛋白质免疫印迹
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鸡LTBP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：2
9
作者 滕蔓 迟佳琦 +1 位作者 柴书军 罗俊 《河南农业科学》 北大核心 2020年第12期144-150,共7页
为了研究鸡潜在转化生长因子结合蛋白(LTBP1)功能,构建原核表达重组质粒pET-30a-LTBP1,转化E.coli BL21感受态细胞并经IPTG诱导进行表达。对以包涵体形式表达的LTBP1蛋白进行变复性和亲和层析纯化,然后免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术... 为了研究鸡潜在转化生长因子结合蛋白(LTBP1)功能,构建原核表达重组质粒pET-30a-LTBP1,转化E.coli BL21感受态细胞并经IPTG诱导进行表达。对以包涵体形式表达的LTBP1蛋白进行变复性和亲和层析纯化,然后免疫Balb/C小鼠,利用细胞融合技术建立单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备抗鸡LTBP1的单克隆抗体。通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选,获得了2株杂交瘤细胞株3C11-A9和2B1-G7。以效价较高的3C11-A9制备单克隆抗体腹水,间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验结果均表明,单克隆抗体3C11-A9可特异性识别鸡源细胞CEF和DF-1表达的LTBP1蛋白,同时IFA结果还显示,3C11-A9单克隆抗体腹水可与包括人、猴、猪和鼠在内的8种常见哺乳动物细胞发生特异性染色。综上,成功制备了抗鸡LTBP1单克隆抗体,且具有多物种广谱识别特性。 展开更多
关键词 鸡 LTBP1 原核表达 单克隆抗体 间接免疫荧光试验 蛋白免疫印迹试验
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鸡异质核糖核蛋白AB单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：2
10
作者 罗俊 党露 +5 位作者 郑鹿平 刘金玲 柴书军 赵东 杨艳艳 滕蔓 《河南农业科学》 北大核心 2022年第2期127-132,共6页
为研制鸡异质核糖核蛋白AB(hnRNPAB)单克隆抗体,为其生物学功能研究提供关键试剂,构建重组质粒pET-30a-hnRNPAB,转化感受态细胞E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过树脂Ni对可溶性表达的鸡hnRNPAB蛋白进行亲和层析纯化之后免疫Balb/c小鼠... 为研制鸡异质核糖核蛋白AB(hnRNPAB)单克隆抗体,为其生物学功能研究提供关键试剂,构建重组质粒pET-30a-hnRNPAB,转化感受态细胞E.coli BL21,经IPTG诱导表达,并通过树脂Ni对可溶性表达的鸡hnRNPAB蛋白进行亲和层析纯化之后免疫Balb/c小鼠,利用细胞融合技术制备抗鸡hnRNPAB的单克隆抗体细胞株,最终通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选获得1株单克隆抗体杂交瘤细胞株5H2-H1。间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)分析表明,5H5-H1单克隆抗体可特异性识别鸡胚成纤维细胞(CEF)表达的hnRNPAB蛋白。同时IFA和间接免疫细胞化学试验(ICA)结果还显示,除了特异性识别鸡hnRNPAB蛋白之外,5H5-H1单克隆抗体还可以与源自人、鼠、猴、牛和猪在内的5种常见哺乳动物细胞系表达的hnRNPAB发生特异性反应。 展开更多
关键词 鸡 异质核糖核蛋白 单克隆抗体 间接免疫荧光试验 Western blot分析 间接免疫细胞化学试验
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