抗菌肽LL-1的鉴定和生物学特性研究 被引量：1

1

作者 周玲玲 王宇航 +4 位作者 李亦菲 柴永乐 张明亮 张元臣 连凯琪 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期491-497,共7页

[目的]获得抗菌肽LL-1的完整基因序列,并研究其生物学特性及抗菌效果,为进一步研究开发抗菌肽药物奠定基础。[方法]本研究通过桃蛀螟转录组测序和比对分析发现一种抗菌肽,命名为LL-1。通过RACE扩增技术获得其完整基因序列,从而推导其氨... [目的]获得抗菌肽LL-1的完整基因序列,并研究其生物学特性及抗菌效果,为进一步研究开发抗菌肽药物奠定基础。[方法]本研究通过桃蛀螟转录组测序和比对分析发现一种抗菌肽,命名为LL-1。通过RACE扩增技术获得其完整基因序列,从而推导其氨基酸序列。通过多重序列比对,获得其裂解后的成熟多肽并进行化学合成。通过建立大肠杆菌感染鸡肉模型,评价LL-1的抑菌效果,并检测其耐盐和耐高温特性。[结果]LL-1基因全长474 bp, ORF长192 bp,编码63个氨基酸残基,成熟的LL-1含有39个氨基酸残基,为天蚕素抗菌肽。50 mg/kg的LL-1能极显著抑制大肠杆菌在鸡肉中增殖(P<0.01)。耐温度特性分析结果表明,在4~50℃范围内,温度对抗菌肽LL-1的抑菌效果没有显著影响;与37℃相比,当100℃处理1 h后,抗菌肽LL-1的抑菌活性显著降低(P<0.05)。耐盐特性分析结果表明,在0~200 mmol/L NaCl溶液处理后,抗菌肽LL-1的抑菌效果未出现显著变化(P>0.05)。[结论]抗菌肽LL-1具有较好的稳定性及抗菌活性,具有开发成新型药物的潜力。 展开更多

关键词 抗菌肽 化学合成 生物学特性 抗菌效果 序列比对

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鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白FliC生物信息学分析及其对小鼠巨噬细胞的作用

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作者 张明亮 王佩 +5 位作者 马磊 姚畅 庞蓉 翁少亭 马圣明 连凯琪 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第8期3820-3829,共10页

【目的】研究鼠伤寒沙门菌Fli C蛋白的序列特征、原核表达情况及其对巨噬细胞RAW264.7增殖及细胞因子分泌的影响。【方法】参照Gen Bank公布的鼠伤寒沙门菌ATCC 14028基因序列设计特异性引物,以鼠伤寒沙门菌ATCC 14028基因组DNA为模板,... 【目的】研究鼠伤寒沙门菌Fli C蛋白的序列特征、原核表达情况及其对巨噬细胞RAW264.7增殖及细胞因子分泌的影响。【方法】参照Gen Bank公布的鼠伤寒沙门菌ATCC 14028基因序列设计特异性引物,以鼠伤寒沙门菌ATCC 14028基因组DNA为模板,通过PCR扩增FliC基因CDS序列,应用在线软件分析FliC蛋白结构特征。将FliC基因克隆至原核表达载体pET-28a(+),将鉴定正确的重组质粒pET-28a-FliC转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组菌株BL21(pET-28a-FliC),使用IPTG对重组菌株进行诱导表达并优化重组蛋白的表达条件,对重组蛋白进行镍离子亲和层析纯化,通过SDS-PAGE及Western blotting检测纯化的蛋白。将纯化的重组蛋白与巨噬细胞RAW264.7共同孵育,通过细胞毒性试验检测巨噬细胞增殖情况,采用ELISA法检测巨噬细胞细胞因子分泌情况。【结果】PCR扩增获得大小为1488bp的FliC基因,FliC蛋白分子式为C_(2194)H_(3597)N_(640)O_(641)S_(3),由495个氨基酸组成,分子质量约为52ku;该蛋白属酸性蛋白,氨基酸残基丙氨酸(12.3%)、苏氨酸(11.5%)出现的频率较高;蛋白为亲水性蛋白,不含信号肽,无跨膜区,包含67个磷酸化位点。二级结构由α-螺旋、β-折叠、β-转角及无规则卷曲构成,占比分别为39.80%、20.20%、4.24%和35.76%。SDS-PAGE及Western blotting检测结果显示,重组蛋白部分可溶,与小鼠抗鞭毛血清有较好的反应原性。50和400ng/m L重组纯化蛋白能有效刺激巨噬细胞的增殖,在24h增殖率达到最高,同时可有效刺激巨噬细胞分泌细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α),在12h时细胞因子分泌量最高。【结论】本研究成功扩增得到鼠伤寒沙门菌FliC基因,纯化获得的高纯度FliC蛋白为酸性、亲水性蛋白,该蛋白可促进巨噬细胞增殖及分泌细胞因子,为进一步研究沙门菌FliC蛋白的功能奠定基础。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 鞭毛蛋白 原核表达 巨噬细胞 生物信息学分析

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抗菌肽LL-1对沙门氏菌的抗菌机制

3

作者 王宇航 周玲玲 +4 位作者 周瑶玲 撒俊梦 张元臣 马增军 连凯琪 《食品科学》 北大核心 2025年第4期110-116,共7页

为探究抗菌肽LL-1对沙门氏菌的抗菌效果及机制,首先通过倍比稀释法测定LL-1对沙门氏菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),并以抗菌曲线评价LL-1对沙门氏菌的抗菌效果;然后,使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察... 为探究抗菌肽LL-1对沙门氏菌的抗菌效果及机制,首先通过倍比稀释法测定LL-1对沙门氏菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),并以抗菌曲线评价LL-1对沙门氏菌的抗菌效果;然后,使用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细菌形态,通过检测核酸、蛋白质、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的泄漏情况以及碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色实验,评价LL-1对沙门氏菌细胞壁和细胞膜的影响,通过核酸凝胶电泳观察LL-1与沙门氏菌DNA结合情况;最后,通过检测胞内琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)、NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-malatedehydrogenase,NADP-MDH)活性以及腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)含量,评价LL-1对沙门氏菌能量代谢的影响。结果表明:LL-1对沙门氏菌的MIC为6.25μg/mL,有良好的抗菌效果,且呈浓度和时间依赖性;经LL-1处理的沙门氏菌出现菌体皱缩、胞膜溶解和质壁分离等形态变化;沙门氏菌经LL-1处理后,胞内核酸、蛋白质、ALP发生泄漏,并且经PI染色后胞内荧光强度增强,同时LL-1与DNA发生结合;随着LL-1质量浓度的升高,胞内ATP含量下降、SDH及NADP-MDH的活性降低。综上,LL-1能增大沙门氏菌细胞膜和细胞壁的通透性引起胞内容物泄漏,结合其DNA,并通过影响细菌能量代谢等方式抗菌,本实验可为后续深入研究LL-1的抗菌机制和应用奠定基础。 展开更多

关键词 沙门氏菌 抗菌肽 抗菌机制 食源性致病菌 细胞膜 能量代谢

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抗菌肽LL-1体内治疗大肠杆菌感染的效果

4

作者 周玲玲 王宇航 +4 位作者 撒俊梦 马小宁 张元臣 连凯琪 曹瑾玲 《河南农业科学》 北大核心 2025年第5期142-148,共7页

为了评估抗菌肽LL-1对大肠杆菌感染小鼠的体内治疗效果,为抗菌肽LL-1的临床应用奠定基础,首先建立大肠杆菌感染小鼠模型,确定最佳感染剂量;然后使用抗菌肽LL-1和恩诺沙星分别对大肠杆菌感染的小鼠模型进行治疗,根据小鼠存活率、血常规... 为了评估抗菌肽LL-1对大肠杆菌感染小鼠的体内治疗效果,为抗菌肽LL-1的临床应用奠定基础,首先建立大肠杆菌感染小鼠模型,确定最佳感染剂量;然后使用抗菌肽LL-1和恩诺沙星分别对大肠杆菌感染的小鼠模型进行治疗,根据小鼠存活率、血常规参数、器官指数、内脏载菌量等指标多方面评价抗菌肽LL-1体内治疗效果,并通过检测小鼠脏器组织学变化来分析抗菌肽LL-1对小鼠的影响。结果表明,建立大肠杆菌感染小鼠模型的最佳感染浓度为10^(8)cfu/mL。阳性对照组(POS组)小鼠存活率为30%,80 mg/kg LL-1治疗组(PEPJ组)小鼠的存活率达到100%;与POS组相比,PEPJ组的小鼠肝脏指数极显著升高,脾脏指数显著降低,脾脏、肺脏大肠杆菌载菌量极显著降低;在小鼠血常规主要参数中,PEPJ组中间细胞计数显著减少;HE染色结果显示,LL-1显著缓解了大肠杆菌感染引起的多器官(肝、脾、肾、肺)病变、炎性细胞浸润,以及肠道绒毛脱落。80 mg/kg LL-1对大肠杆菌感染小鼠的总体治疗效果优于200 mg/kg恩诺沙星治疗组。综上,抗菌肽LL-1对小鼠具有良好的体内抗大肠杆菌作用,为今后更深入研究该抗菌肽的作用及临床应用奠定基础。 展开更多

关键词 抗菌肽 大肠杆菌 体内抗菌 小鼠感染模型 临床应用

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4-萜烯醇对大肠杆菌的抗菌作用研究

5

作者 周玲玲 王宇航 +2 位作者 张元臣 张明亮 连凯琪 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第9期4497-4504,共8页

【目的】评价4-萜烯醇的抗菌活性,为其结构优化改造和临床应用提供支撑。【方法】本试验以大肠杆菌为模式菌,通过倍比稀释法测定4-萜烯醇对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC);通过测定D600 nm值绘制其抑菌曲线;扫描电子显微镜观察4-萜烯醇对... 【目的】评价4-萜烯醇的抗菌活性,为其结构优化改造和临床应用提供支撑。【方法】本试验以大肠杆菌为模式菌,通过倍比稀释法测定4-萜烯醇对大肠杆菌的最小抑菌浓度(MIC);通过测定D600 nm值绘制其抑菌曲线;扫描电子显微镜观察4-萜烯醇对大肠杆菌形态的影响。测定胞外碱性磷酸酶(ALP)和β-半乳糖苷酶的含量评价4-萜烯醇对大肠杆菌细胞膜的影响;使用超微量分光光度计检测大肠杆菌核酸和蛋白质的泄漏情况;用核酸凝胶电泳检测4-萜烯醇对大肠杆菌DNA的影响。【结果】4-萜烯醇对大肠杆菌的MIC为0.013 mol/L,其对大肠杆菌的抑制作用呈浓度依赖性,1 MIC的4-萜烯醇能在24 h内完全抑制大肠杆菌增殖。经4-萜烯醇处理后的大肠杆菌菌体肿胀变形、表面粗糙、菌体间黏连。与对照组相比,0.5 MIC的4-萜烯醇能导致大肠杆菌上清中ALP含量显著升高(P<0.05),β-半乳糖苷酶含量极显著升高(P<0.01),且与4-萜烯醇浓度呈正相关;0.5 MIC的4-萜烯醇即可导致大肠杆菌上清中蛋白质和核酸含量增高,且与4-萜烯醇浓度和作用时间呈正相关。4-萜烯醇与大肠杆菌DNA没有结合作用。【结论】4-萜烯醇对大肠杆菌具有良好的抗菌效果,能通过增加细胞膜的通透性,进而使胞内容物泄漏使细菌死亡。试验结果为深入研究4-萜烯醇对大肠杆菌的抗菌机制奠定基础。 展开更多

关键词 4-萜烯醇 大肠杆菌 细胞膜 抗菌作用

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猪流行性腹泻病毒截短M基因克隆、生物信息学分析及其截短片段表达 被引量：2

6

作者 张明亮 耿亚春 +4 位作者 连凯琪 马磊 常莹 王双山 张福良 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2022年第4期1479-1487,共9页

【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物,以从阳性病料提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M... 【目的】探索猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)截短M蛋白的序列结构特征与原核表达情况。【方法】根据已公布的PEDV M基因序列设计1对特异性引物,以从阳性病料提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增并克隆PEDV截短的M基因(rM),应用在线生物信息学软件预测rM蛋白的结构特征。将得到的截短的M基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a-rM,将鉴定正确的pET-28a-rM转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,成功构建重组菌株BL21(pET-28a-rM),并对重组菌株进行IPTG诱导表达,优化重组蛋白的表达条件,重组蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE及Western blotting检测,同时应用重组蛋白制备兔抗rM多克隆抗体。【结果】试验克隆得到大小为366 bp的截短的M基因,重组蛋白由121个氨基酸组成,预测蛋白分子质量大小约为12.8 ku。该蛋白的二级结构由无规则卷曲、延伸链、β-转角和α-螺旋组成,占比分别为48.76%、33.88%、9.09%和8.26%。该蛋白不含信号肽,但有跨膜区,包含21个磷酸化位点。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白大小约为15 ku,以包涵体蛋白形式存在,在37℃、1 mmol/L IPTG诱导12 h时蛋白的表达量最高。Western blotting检测结果表明,重组蛋白与PEDV阳性血清具有较好的反应原性,纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得的高免血清效价高于1∶51200。【结论】本研究成功克隆PEDV截短的M基因,对rM蛋白进行了生物信息学分析,获得了高纯度的rM蛋白,为猪流行性腹泻治疗及检测用生物制品的开发奠定了基础。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) M基因 生物信息学分析 原核表达

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抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌ATCC 700603的抗菌机制 被引量：2

7

作者 连凯琪 王宇航 +5 位作者 曾雅静 周玲玲 张元臣 张明亮 张改平 王双山 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2237-2244,共8页

【目的】探明新抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的抗菌效果和机制。【方法】测定抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),通过抑菌曲线评价抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌的体外抗... 【目的】探明新抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的抗菌效果和机制。【方法】测定抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),通过抑菌曲线评价抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌的体外抗菌效果;通过检测碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、核酸、蛋白质的泄露,评价抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌细胞膜和细胞壁的影响;通过核酸凝胶电泳检测抗菌肽LL-1与肺炎克雷伯菌DNA的结合作用;通过扫描电子显微镜观察抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌菌体形态的影响。【结果】抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌具有良好的抗菌活性,MIC为50μg/mL;抑菌曲线表明,抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌具有生长抑制作用,且2 MIC的抗菌肽LL-1在6 h内能完全抑制肺炎克雷伯菌;抗菌肽LL-1能导致肺炎克雷伯菌的ALP和β-半乳糖苷酶发生泄漏,且1/4 MIC的抗菌肽LL-1即可导致其泄漏量极显著高于对照组(P<0.01);核酸和蛋白质泄露的检测结果进一步证实抗菌肽LL-1能导致肺炎克雷伯菌胞内容物外流;此外抗菌肽LL-1还能与肺炎克雷伯菌DNA结合;扫描电子显微镜观察显示,抗菌肽LL-1会导致肺炎克雷伯菌表面变得粗糙、菌体变形等。【结论】抗菌肽LL-1能增加肺炎克雷伯菌细胞壁和细胞膜的通透性,并结合其DNA,从而发挥抗菌作用,本研究结果将为深入研究抗菌肽LL-1对肺炎克雷伯菌的抗菌机制奠定基础。 展开更多

关键词 抗菌肽 肺炎克雷伯菌 抗菌机制 细胞壁 细胞膜

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基于网络药理学探讨艾草抗鸡马立克病毒的活性成分与作用机制 被引量：2

8

作者 马圣明 张福良 +3 位作者 翁少亭 邢月腾 王尧 张坤朋 《河南农业科学》 北大核心 2024年第3期133-140,共8页

运用网络药理学方法探讨艾草抗鸡马立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)的活性成分、作用靶点及可能的作用机制。利用TCMSP数据库检索艾草化学成分和作用靶点,查阅文献收集MDV相关宿主基因靶点,建立靶点数据库;利用STRING数据库结合Cy... 运用网络药理学方法探讨艾草抗鸡马立克病毒(Marek’s disease virus,MDV)的活性成分、作用靶点及可能的作用机制。利用TCMSP数据库检索艾草化学成分和作用靶点,查阅文献收集MDV相关宿主基因靶点,建立靶点数据库;利用STRING数据库结合Cytoscape 3.8.0软件构建靶点蛋白相互作用网络及活性成分-关键靶点网络,筛选核心靶点和主要活性成分;利用DAVID数据库对关键靶点进行GO功能分析和KEGG通路富集分析;最后利用分子对接技术验证主要活性成分与关键靶点的结合能力。结果显示,从艾草中筛选出8种活性成分,共有108个基因靶点与MDV宿主基因存在相互作用,艾草抗MDV作用的主要靶点有JUN、CCND1、CDK1、IL-6等;GO功能分析涉及细胞活性、炎症反应等过程,KEGG富集分析涉及C型凝集素受体信号通路、MAPK信号通路、细胞衰老、p53信号通路、细胞凋亡、Toll样受体信号通路等;异泽兰黄素与靶点蛋白CCND1的对接能力最强。结果表明,艾草主要活性成分异泽兰黄素可能是通过作用于CCND1,干预细胞周期影响细胞活性,进而发挥抗MDV效应。 展开更多

关键词 艾草 网络药理学 马立克病毒 活性成分 靶点

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新型黏虫抗菌肽AAP-1对大肠杆菌的抗菌作用 被引量：4

9

作者 连凯琪 周玲玲 +5 位作者 张元臣 时志琪 林正丹 宋玉伟 王双山 张明亮 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第11期3626-3632,共7页

为评价一种新型黏虫抗菌肽(armyworm antimicrobial peptide 1,AAP-1)的抗菌活性,本试验首先采用固相化学合成法合成AAP-1,并通过高效液相色谱纯化和质谱检验,用抑菌圈法测定AAP-1对大肠杆菌的抗菌效果,倍比稀释法检测最小抑菌浓度(mini... 为评价一种新型黏虫抗菌肽(armyworm antimicrobial peptide 1,AAP-1)的抗菌活性,本试验首先采用固相化学合成法合成AAP-1,并通过高效液相色谱纯化和质谱检验,用抑菌圈法测定AAP-1对大肠杆菌的抗菌效果,倍比稀释法检测最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),细菌平板计数法测定时间抗菌曲线;最后,通过超微量分光光度计评价AAP-1对大肠杆菌核酸泄露的影响,核酸凝胶电泳评价AAP-1对大肠杆菌胞内DNA的影响,透射电子显微镜观察评价AAP-1对大肠杆菌的整体作用效果。结果表明,合成的AAP-1纯度高于98%,分子质量为4262.17 u;AAP-1对大肠杆菌具有良好的抗菌活性,MIC为7.8μg/mL;对大肠杆菌的抗菌作用具有浓度依赖性,且在60 min内抗菌效果逐渐增强;AAP-1能够导致大肠杆菌核酸泄露,致使胞内DNA总量减少,且呈现浓度依赖性;AAP-1也会导致大肠杆菌细胞膜破坏、胞内电子密度明显降低、胞质溶解等现象。综上,本研究化学合成了一种新型抗菌肽AAP-1,且纯度高达98%,其对大肠杆菌具有良好的抗菌效果。本研究可为深入研究AAP-1对大肠杆菌的抗菌机制提供前期数据,可为APP-1的临床应用奠定理论基础。 展开更多

关键词 抗菌肽 大肠杆菌 抗菌曲线 细胞膜

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豫北地区猪源大肠杆菌耐药性及基因多态性分析 被引量：7

10

作者 张明亮 周玲玲 +3 位作者 连凯琪 周孝蕊 宋玉伟 王双山 《中国兽药杂志》 2019年第4期16-22,共7页

为了解豫北地区规模化养殖场猪源大肠杆菌的耐药性及基因多态性,对分离的21株猪源大肠杆菌进行药物敏感实验,采用PCR技术对其耐药基因进行检测,RAPD技术进行基因多态性分析。结果表明:豫北地区规模化养殖场分离的猪源性大肠杆菌菌株对常... 为了解豫北地区规模化养殖场猪源大肠杆菌的耐药性及基因多态性,对分离的21株猪源大肠杆菌进行药物敏感实验,采用PCR技术对其耐药基因进行检测,RAPD技术进行基因多态性分析。结果表明:豫北地区规模化养殖场分离的猪源性大肠杆菌菌株对常见16种抗生素存在不同情况的耐药性。其中对四环素、红霉素、麦迪霉素、阿莫西林、磺胺异恶唑、环丙沙星、新生霉素、复方新诺明、恩诺沙星、甲氧苄啶的耐药率均为100%,对庆大霉素、洛美沙星的耐药率为85%以上,对其他药物的耐药率相对较低;PCR检测得到8种耐药基因的条带;对菌株进行RAPD分析得到7种不同的基因型。大肠杆菌极易产生耐药性,耐药基因广泛存在于耐药菌株中,但耐药表型与耐药基因之间无绝对相关性。豫北地区猪源大肠杆菌感染多重耐药十分严重,严重影响了该地区猪源大肠杆菌病的诊治和预防。 展开更多

关键词 猪源大肠杆菌 药物敏感实验 耐药基因 RAPD技术

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猪硒蛋白W的原核表达及IgY多克隆抗体制备 被引量：2

11

作者 周继萍 曹瑞敏 +2 位作者 米克热木·沙依布扎提 蒋志惠 张小莺 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第6期1801-1807,共7页

试验旨在优化硒蛋白W(selenoprotein W,SelW)的原核表达系统,并评估SelW的免疫原性和基于IgY抗体检测猪体内SelW的可行性。将获得的猪SelW基因序列密码子进行优化、合成并连接至pET-32a(+)表达载体中,构建原核表达重组质粒pET32a(+)-Se... 试验旨在优化硒蛋白W(selenoprotein W,SelW)的原核表达系统,并评估SelW的免疫原性和基于IgY抗体检测猪体内SelW的可行性。将获得的猪SelW基因序列密码子进行优化、合成并连接至pET-32a(+)表达载体中,构建原核表达重组质粒pET32a(+)-SelW,转化E.coli BL21(DE3)宿主菌中,进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定重组猪SelW的表达情况,并免疫产蛋鸡制备抗SelW的IgY多克隆抗体,通过间接ELISA检测IgY抗体滴度,采用Western blotting检测IgY识别抗原的特异性。SDS-PAGE结果显示,SelW基因在原核细胞中成功表达,得到了大小约为33 ku的重组蛋白,IPTG最佳诱导浓度及时间分别为0.5 mmol/L和6 h;可溶性分析结果显示,重组蛋白SelW主要以包涵体形式存在。间接ELISA检测结果显示,免疫后45 d的IgY多克隆抗体的效价可达1∶51 200。Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的免疫原性,所制备的IgY抗体与SelW的亲和力较高。本试验成功构建并优化了SelW蛋白的原核表达系统,提高了SelW蛋白的表达量,获得了具有良好免疫原性的SelW蛋白,制备的IgY抗体能特异性识别猪肌肉组织中的SelW,可用于检测猪组织中SelW的表达、预防硒中毒和缺硒性疾病的监测等,为进一步探究SelW的生物学功能奠定基础。 展开更多

关键词 猪 硒蛋白W(SelW) 原核表达 IgY多克隆抗体

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贮存年份对北艾和蕲艾精油成分与抑菌活性的影响研究 被引量：14

12

作者 蒋志惠 郑婧龙 +5 位作者 谷令彪 李志祥 刘运革 马立静 王敏 申艳红 《天然产物研究与开发》 CAS CSCD 2021年第2期227-235,207,共10页

本文采用水蒸汽蒸馏法提取了贮存0、1、2年的北艾和蕲艾精油,采用GC-MS检测精油化学成分,选取10种常见细菌,检测了其抗菌谱和最小杀菌浓度。结果发现:0、1年份北艾精油中小分子挥发性物质较多,随着贮存年份的增加,大分子挥发性物质随之... 本文采用水蒸汽蒸馏法提取了贮存0、1、2年的北艾和蕲艾精油,采用GC-MS检测精油化学成分,选取10种常见细菌,检测了其抗菌谱和最小杀菌浓度。结果发现:0、1年份北艾精油中小分子挥发性物质较多,随着贮存年份的增加,大分子挥发性物质随之增加;侧柏酮为蕲艾的特有成分。0年份艾叶精油的抑菌活性较高,对沙门菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌耐药菌、绿脓杆菌均具有抑制作用。综上,不同贮存年份和品种的艾叶精油在化学成分、抗菌谱和抑菌活性方面均存在差异,综合考虑精油含量和抑菌活性,以0年份的北艾为原料提取精油最佳。 展开更多

关键词 艾叶 精油 化学成分 抑菌活性

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新发猪圆环病毒3型Cap蛋白的原核表达和纯化 被引量：8

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作者 连凯琪 周玲玲 +3 位作者 张明亮 王英杰 张慢 宋玉伟 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第11期120-123,129,共5页

为制备新发猪圆环病毒3型(PCV-3)衣壳蛋白(Cap)的抗原,在大肠杆菌中表达Cap蛋白,并对其进行纯化。通过PCR扩增去除核定位信号区的Cap136—645基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Cap136—645,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,然后通... 为制备新发猪圆环病毒3型(PCV-3)衣壳蛋白(Cap)的抗原,在大肠杆菌中表达Cap蛋白,并对其进行纯化。通过PCR扩增去除核定位信号区的Cap136—645基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Cap136—645,转化到E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达,然后通过SDS-PAGE电泳和Western blot分析进行鉴定,并纯化Cap136—645蛋白。结果表明,成功构建了pET30a(+)-Cap136—645重组表达质粒,且可在E.coli BL21(DE3)感受态细胞中可大量表达,表达的重组蛋白主要以包涵体形式表达,分子质量约为27.5 ku,纯化的蛋白质质量浓度高达1.28μg/μL,且条带单一。 展开更多

关键词 猪圆环病毒3型 包涵体 原核表达 蛋白质纯化

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艾草的化学成分和药理作用研究进展 被引量：60

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作者 蒋志惠 常雪梅 +4 位作者 张照然 曲毅程 田灿 谷令彪 张守泉 《中国兽药杂志》 2019年第2期76-85,共10页

艾草为我国传统的中草药,其应用在我国有着悠久的历史和广泛的影响。早在明代李时珍的《本草纲目》中就有记载,称其为"草医"。对艾草的理化性质、提取方法、主要的化学成分、药理学作用和应用进行国内外文献研究总结。艾草主... 艾草为我国传统的中草药,其应用在我国有着悠久的历史和广泛的影响。早在明代李时珍的《本草纲目》中就有记载,称其为"草医"。对艾草的理化性质、提取方法、主要的化学成分、药理学作用和应用进行国内外文献研究总结。艾草主要的化学成分为挥发油类、黄酮类和糖类,具有抑菌、抗虫、抗氧化和提高动物生产性能的作用,开发出了具有抑菌、增强免疫力等功效的产品。基于目前的文献研究,提出仍需深入研究艾草调控的信号转导通路、艾草的药物代谢动力学参数、艾草的安全性评价以及药物间的相互作用等。该综述以期为艾草的药理机制研究和提高艾草的应用价值提供全面的数据支撑。 展开更多

关键词 艾草 化学成分 提取方法 药理作用

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罗斯308肉鸡不同鸡舍间生长势对比分析 被引量：1

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作者 杨新蕾 马发顺 +1 位作者 马圣明 张春霞 《当代畜禽养殖业》 2020年第10期10-11,14,共3页

为了掌握罗斯308肉鸡在不同鸡舍间的生长势情况,在滑县某肉鸡场随机选择两栋鸡舍(A1和A2),每栋鸡舍按0~4周龄各抽取罗斯308肉鸡40只,进行体重测量,并进行不同鸡舍间肉鸡体重的对比分析和生长发育指标计算。结果表明,0~4周龄罗斯308肉鸡... 为了掌握罗斯308肉鸡在不同鸡舍间的生长势情况,在滑县某肉鸡场随机选择两栋鸡舍(A1和A2),每栋鸡舍按0~4周龄各抽取罗斯308肉鸡40只,进行体重测量,并进行不同鸡舍间肉鸡体重的对比分析和生长发育指标计算。结果表明,0~4周龄罗斯308肉鸡体重增长呈上升趋势,变异度具有波动性;两栋鸡舍的肉鸡体重在0~3周龄生长势差异不显著(P>0.05),4周龄时生长势差异极显著(P<0.01);两栋鸡舍的肉鸡绝对生长均呈上升趋势,1~3周龄时两者基本一致,4周龄A2显著大于A1;两栋鸡舍的肉鸡相对生长均呈下降趋势,但下降幅度存在差异。由此可见,罗斯308肉鸡在不同鸡舍间的生长势具有一定的差异。 展开更多

关键词 罗斯308肉鸡 鸡舍 体重 生长势

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汤阴北艾精油对鼠CYP450酶活性和表达的影响 被引量：1

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作者 蒋志惠 张静苗 +3 位作者 曲毅程 张守泉 常雪梅 郭晓 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第11期3440-3448,共9页

试验旨在研究汤阴北艾精油对CYP450酶各亚型活性和表达的影响。采用水蒸馏提取法提取北艾精油,通过GC-MS检测北艾精油成分。为研究北艾精油对CYP450酶活性的影响,将SD大鼠随机分为对照组(CON)和北艾精油组(EO),分别灌胃0.1%吐温-80100μ... 试验旨在研究汤阴北艾精油对CYP450酶各亚型活性和表达的影响。采用水蒸馏提取法提取北艾精油,通过GC-MS检测北艾精油成分。为研究北艾精油对CYP450酶活性的影响,将SD大鼠随机分为对照组(CON)和北艾精油组(EO),分别灌胃0.1%吐温-80100μL/g和0.1%吐温-80稀释的北艾精油(5%)100μg/g,灌胃后给予20μg/g各探针药物,采用鸡尾酒探针法分别对给药后5、10、20、30 min及1、2、3、6、12、24、36、48 h血浆中3种探针底物的浓度进行检测,考察北艾精油对CYP1A2、CYP2E1和CYP2D6酶活性的影响;为探究北艾精油对CYP450酶基因和蛋白表达的影响,将昆明小鼠随机分为对照组和北艾精油组,分别灌胃0.1%吐温-80100μL/g和0.1%吐温-80稀释的北艾精油(5%)100μg/g,连续灌胃3日,每日2次,末次给药24 h后提取总mRNA及肝微粒体,采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法(Western blotting)测定CYP1A2、CYP2E1和CYP2D6 mRNA和蛋白表达含量。结果表明:①北艾精油主要成分为Eucalyptol;3-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)-3;(+)-2-Carene,4-.alpha.-isopropenyl-2;m-Mentha-4,8-diene,(1S,3S)-(+)-;Benzoic acid,2,4,6-trimethyl-2,4,6-trimethylphenyl ester。②对血液中非那西汀(CYP1A2底物)、右美沙芬(CYP2D6底物)和氯唑沙宗(CYP2E1底物)进行药代动力学分析可知,北艾精油具有抑制CYP2D6和CYP2E1酶活性的作用,而对CYP1A2酶活性无显著作用。③实时荧光定量PCR和Western blotting测定结果表明,北艾精油可显著抑制CYP2E1和CYP2D6酶的表达。综上,北艾精油对CYP2E1和CYP2D6酶活性和表达均具有明显的抑制作用,提示艾草精油不能同时与以CYP2D6和CYP2E1为主要代谢酶的药物同食。该研究结果可为北艾精油的合理用药提供数据基础。 展开更多

关键词 艾草 精油 药代动力学 CYP450酶

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塞尼卡谷病毒3ABC蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备 被引量：1

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作者 连凯琪 周玲玲 +4 位作者 张明亮 张慢 王英杰 林正丹 宋玉伟 《河南农业科学》 北大核心 2020年第1期123-127,共5页

为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3 ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通... 为了开发塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)的检测试剂盒,克隆3 ABC基因进行原核表达和纯化,并将纯化的3ABC蛋白免疫大鼠,制备抗3ABC蛋白的多克隆抗体。通过Western blot鉴定制备的多克隆抗体与表达的3ABC蛋白的特异性识别能力,通过ELISA测定多克隆抗体的效价。结果显示,3 ABC基因在大肠杆菌中大量表达,且主要以包涵体形式表达,重组蛋白分子质量约为55 ku,经纯化后得到单一条带。免疫大鼠制备的多克隆抗体效价大于1∶64000,且与表达的3ABC重组蛋白发生特异性反应。综上,在大肠杆菌中成功表达了SVV 3ABC蛋白,且表达的重组蛋白具有免疫原性。 展开更多

关键词 塞尼卡谷病毒 3ABC蛋白 原核表达 蛋白质纯化 多克隆抗体

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抗菌肽杀菌效果、机制研究方法进展 被引量：11

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作者 时志琪 连凯琪 +1 位作者 林正丹 马园园 《中国畜禽种业》 2020年第11期52-53,共2页

抗生素的广泛应用已造成大量耐药菌的产生,同时也导致环境污染,抗菌肽有望作为抗生素的替代品,已受到广泛关注和研究。研究者通过分离纯化、体外合成、表达等方式获得抗菌肽,进而研究抗菌肽体外和体内的杀菌效果及杀菌机制,在此过程中... 抗生素的广泛应用已造成大量耐药菌的产生,同时也导致环境污染,抗菌肽有望作为抗生素的替代品,已受到广泛关注和研究。研究者通过分离纯化、体外合成、表达等方式获得抗菌肽,进而研究抗菌肽体外和体内的杀菌效果及杀菌机制,在此过程中建立很多相关的研究方法。本文旨在对抗菌肽杀菌效果、最小抑菌浓度、杀菌动力学曲线及杀菌机制等常用的研究方法进行综述,以期为后续抗菌肽抑菌研究提供参考。 展开更多

关键词 抗菌肽 杀菌效果 最小抑菌浓度 杀菌动力学曲线 杀菌机制 研究方法 进展

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猪IgG1-Fc基因的克隆、原核表达及表达条件优化

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作者 连凯琪 周玲玲 +3 位作者 王英杰 李翠 宋玉伟 张明亮 《江苏农业科学》 2019年第15期91-94,共4页

为了探索猪IgG1-Fc(pIgG1-Fc)基因在大肠杆菌中的高效表达,首先通过反转录PCR(RT-PCR)扩增pIgG1-Fc基因,并构建重组表达质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,然后通过优化异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度... 为了探索猪IgG1-Fc(pIgG1-Fc)基因在大肠杆菌中的高效表达,首先通过反转录PCR(RT-PCR)扩增pIgG1-Fc基因,并构建重组表达质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达,然后通过优化异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导浓度、菌体培养温度及菌体培养时间,实现pIgG1-Fc重组蛋白的高效表达。结果表明,成功克隆了pIgG1-Fc的基因666bp,共编码222个氨基酸;重组原核表达质粒pET30a(+)-pIgG1-Fc经过酶切和测序证明构建正确,重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中能够表达,表达的融合蛋白分子量约为36ku。其最佳表达条件如下:在25℃条件下加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h可形成大量包涵体蛋白。pIgG1-Fc基因被成功克隆并原核表达,为进一步研究该蛋白的功能及实现其他蛋白与pIgG1-Fc融合后原核表达奠定了基础,为制备能与猪IgG1结合的二抗提供了材料。 展开更多

关键词 FC 原核表达 包涵体 融合蛋白

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猪圆环病毒3型的诊断及防控措施 被引量：2

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作者 马园园 连凯琪 《今日畜牧兽医》 2019年第11期29-30,共2页

猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3 PCV3)是一种新型的圆环病毒,可引起猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种病症,一般为继发感染和混合感染,给我国的养猪行业带来了较大的经济损失。在疾病诊断方面已有多种方法可以诊断PCV3,... 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3 PCV3)是一种新型的圆环病毒,可引起猪繁殖障碍、断奶仔猪多系统衰竭综合征等多种病症,一般为继发感染和混合感染,给我国的养猪行业带来了较大的经济损失。在疾病诊断方面已有多种方法可以诊断PCV3,但是现在并无治疗PCV3感染的一些药物和能有效预防PCV3发生的疫苗,主要以生物安全预防为主。本文主要对PCV3的临床症状、诊断方法和防控措施进行综述,以期为PCV3的防控以及净化提供参考。 展开更多

关键词 PCV3病毒 诊断 相关病症 防控建议

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