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非洲猪瘟病毒D205R蛋白单克隆抗体的制备和抗原表位鉴定
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作者 林志钊 赵燕燕 +6 位作者 任豪杰 史赛燕 韩世充 何文瑞 万博 张雨杭 张改平 《河南农业科学》 北大核心 2025年第2期124-130,共7页
非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表... 非洲猪瘟(ASF)是一种致命的传染病,迄今为止,还没有开发出有效的疫苗或药物用于预防或控制ASF。为提供诊断非洲猪瘟病毒(ASFV)的重要材料,利用大肠杆菌系统表达ASFV重组D205R蛋白,制备D205R蛋白的单克隆抗体(mAb),鉴定mAb识别的抗原表位。结果显示,成功构建pET32a-D205R表达质粒,并纯化大小约为44 ku的重组D205R蛋白。蛋白质免疫印迹(Western blot)检测结果表明,重组D205R蛋白与ASFV阳性血清发生特异性反应,有良好的免疫原性。利用杂交瘤细胞融合、筛选的方法,得到mAb 19A5。Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测结果表明,mAb 19A5能特异性识别真核表达的重组D205R蛋白,并能检测到野生型D205R蛋白。用丙氨酸扫描法鉴定出167-SDPPVVWLGGRPGD-180是mAb 19A5的抗原表位,S167、W173、L174、G175、P178和D180是与mAb19A5结合的关键氨基酸。保守性和结构分析表明,抗原表位高度保守,且位于蛋白质表面,是线性表位。综上,成功制备mAb 19A5,并鉴定了mAb 19A5识别的抗原表位。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D205R蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究 被引量：4
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作者 常雯茹 段利芳 +9 位作者 杨乐 马英先 王棋 翟云云 周鲁豫 张爽 明胜利 杨国宇 王江 褚贝贝 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第1期83-92,共10页
试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取... 试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 NF-ΚB 猪 伪狂犬病病毒(PRV)
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非洲猪瘟病毒H240R蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备 被引量：5
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作者 李佳佳 东梦珂 +5 位作者 郑南南 吴宏举 张昂克 张改平 万博 杜永坤 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第3期101-106,共6页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的急性、高热、严重出血、致死率极高的动物传染病,给我国养殖业造成严重的经济损失。本研究将非洲猪瘟病毒H240R基因克隆至pET-28a(+)载体中,成功构建了pET-28a(+)-H240R原核表达载体,将重组... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的急性、高热、严重出血、致死率极高的动物传染病,给我国养殖业造成严重的经济损失。本研究将非洲猪瘟病毒H240R基因克隆至pET-28a(+)载体中,成功构建了pET-28a(+)-H240R原核表达载体,将重组载体转化入BL21感受态细胞,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot鉴定结果表明,成功获得了H240R重组蛋白,将其纯化后作为抗原免疫新西兰大白兔,分离血清并分析其反应特异性。ELISA检测结果显示,血清抗体效价达到1∶256000。Western blot和间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明,制备的兔源多克隆抗体能够同时与原核和真核表达的H240R蛋白反应。本研究成功制备针对ASFV H240R蛋白的多克隆抗体,该多克隆抗体具有良好的反应活性及特异性,为建立针对ASFV抗原、抗体的免疫学检测方法提供了新的思路。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 H240R蛋白 原核表达 多克隆抗体
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