AAV-SaCas9敲除MSTN基因病毒的构建及鉴定 被引量：3

1

作者 汪新建 樊爽爽 +3 位作者 翁少亭 杨国宇 褚贝贝 王江 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第1期118-121,共4页

为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-29... 为了研究肌肉生长抑制素(MSTN)的相关功能,应用分子生物学方法构建敲除MSTN的AAVSaCas9载体,通过转染293T细胞提取基因组后进行T7酶切鉴定、TA克隆及测序确定该基因的敲除效果;将鉴定正确的AAV-SaCas9重组质粒与pHelper质粒共转染AAV-293细胞3 d后,分离纯化病毒并用实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。结果显示,成功构建了敲除MSTN基因的AAV-SaCas9重组载体,T7酶切和测序鉴定出sgRNA2位点可以对MSTN进行编辑,并成功将其包装成病毒,经荧光定量PCR鉴定病毒滴度为2.73×10^(12)vg/mL。 展开更多

关键词 肌肉生长抑制素基因 CRISPR-Cas9 腺相关病毒载体 293T细胞

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CFTR基因在小鼠肠道组织中的差异表达 被引量：2

2

作者 王月影 韩莹倩 +2 位作者 查光明 汪新建 李和平 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2014年第5期49-52,70,I0008,共6页

目的研究肠道组织CFTR基因表达与分泌性腹泻发生的关系。方法选取KM小鼠24只,雌雄各半,随机分为3组(每组8只):对照组经小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水,实验组小鼠经腹腔注射LPS[6 mg/(kg·bw)]分别作用1 h、8 h,于注射后通过小鼠精神... 目的研究肠道组织CFTR基因表达与分泌性腹泻发生的关系。方法选取KM小鼠24只,雌雄各半,随机分为3组(每组8只):对照组经小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水,实验组小鼠经腹腔注射LPS[6 mg/(kg·bw)]分别作用1 h、8 h,于注射后通过小鼠精神状态、肠道组织形态学判定分泌性腹泻模型的建立,利用荧光定量PCR法检测各段肠道组织CFTR基因的表达。结果 LPS成功诱导小鼠发生了分泌性腹泻;CFTR基因在小鼠十二指肠、空肠、回肠和结肠组织中均有不同的表达丰度,以结肠最高,但各段肠道间差异不显著;与对照组相比,LPS上调了十二指肠、空肠和回肠CFTR基因的转录,下调了结肠CFTR基因的转录。结论提示肠道组织CFTR基因转录水平的上调与LPS诱导分泌性腹泻的发生密切相关,且在各肠段发挥的作用不同,其中空肠在氯离子(Cl-)分泌中发挥主要作用,结肠的作用最弱。 展开更多

关键词 CFTR基因 小鼠 肠道 表达 荧光定量PCR

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猪Lipin基因克隆及其组织分布的研究 被引量：1

3

作者 鲁维飞 王静 +3 位作者 李宏基 郭豫杰 李奎 杨国宇 《江西农业学报》 CAS 2013年第11期92-94,100,共4页

采用逆转录PCR、电泳检测等方法，成功克隆得到了猪的Lipin1、Lipin2和Lipin3基因。这3个基因与小鼠的相应基因均具有较高的同源性，达83．2％～86．7％。组织分布结果显示：Lipin1广泛分布在猪的多种组织中，但Lipin2和Lipin3仅在肌肉... 采用逆转录PCR、电泳检测等方法，成功克隆得到了猪的Lipin1、Lipin2和Lipin3基因。这3个基因与小鼠的相应基因均具有较高的同源性，达83．2％～86．7％。组织分布结果显示：Lipin1广泛分布在猪的多种组织中，但Lipin2和Lipin3仅在肌肉、肺、回肠和睥中有分布。 展开更多

关键词 猪 Lipin基因 克隆 序列分析 组织分布

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猪akirin2基因的组织表达谱及序列分析

4

作者 郭豫杰 高会贞 +3 位作者 李宏基 王月影 李奎 杨国宇 《江苏农业科学》 北大核心 2016年第1期25-28,共4页

克隆猪的akirin2基因,并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp(Gen Bank登录号KC140110.1),推测的氨基酸序列包含203个氨基酸,为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、... 克隆猪的akirin2基因,并对该基因在猪的18个组织中的分布进行研究。猪akirin2基因编码区全长为612 bp(Gen Bank登录号KC140110.1),推测的氨基酸序列包含203个氨基酸,为酸性蛋白。利用BLAST工具对克隆到的猪akirin2基因序列与人、大鼠、小鼠、绵羊和牛的序列进行同源性比较。采用软件对氨基酸序列进行分析,用相关序列的比对结果进行系统进化树分析。组织分布结果显示,猪akirin2基因在脑组织中高表达,在淋巴、睾丸中表达量相对较低,在心脏、十二指肠、直肠、皮肤、胸腺中几乎检测不到该基因的表达。序列分析结果显示,猪akirin2基因与绵羊和牛的同源性最高,均为96%,与人、小鼠、大鼠的同源性分别为95%、91%、89%。氨基酸序列分析发现,存在1个10个肽的核定位信号序列19-PASPKRRRCA-28,推测的氨基酸序列的二级结构中含有2个a-螺旋。在重建的系统进化树上,几个不同物种的akirin2蛋白分成3支,结果表明猪akirin2与人、牛和羊的亲缘关系比其与小鼠和大鼠的近,与鸡的亲缘关系最远。 展开更多

关键词 猪 akirin2基因 克隆 组织分布 序列分析 基因功能

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猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达

5

作者 曹菁菁 张晓梅 +4 位作者 鲁维飞 郭豫杰 韩立强 王林枫 杨国宇 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第9期75-79,共5页

本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,... 本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布。基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律。克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5%、69.0%、77.3%、70.4%;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5%、79.4%、89.4%、88.2%;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠。 展开更多

关键词 猪 硫辛酸合成酶基因 克隆 组织表达

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合理认识和正确对待转基因

6

作者 汪新建 郭豫杰 +2 位作者 王月影 李宏基 杨国宇 《中国猪业》 2016年第4期62-64,共3页

随着越来越多的转基因产品投放到市场,关于转基因安全的问题逐渐为人们所关注。由于人们对生物技术与转基因的了解不一,所以对转基因食品消费和安全的认知也有差异。本文对转基因技术、转基因安全及国家相关法律进行了阐述,以期增强广... 随着越来越多的转基因产品投放到市场,关于转基因安全的问题逐渐为人们所关注。由于人们对生物技术与转基因的了解不一,所以对转基因食品消费和安全的认知也有差异。本文对转基因技术、转基因安全及国家相关法律进行了阐述,以期增强广大群众对转基因的认识,使转基因发挥更大的社会效益。 展开更多

关键词 农业转基因 转基因产品 转基因安全 转基因法规

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非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：9

7

作者 齐艳丽 刘桃雪 +5 位作者 于海深 张超 鲁维飞 王江 褚贝贝 张改平 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期281-292,共12页

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4... 旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示:成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,特异性强,所获抗体均识别p54蛋白C端127—146 aa肽段。本研究成功获得了ASFV p54蛋白和p54单克隆抗体,并鉴定了6株单克隆抗体的抗原表位,为p54蛋白功能研究和ASFV新型表位疫苗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p54蛋白 原核表达 单克隆抗体 间接ELISA 抗原表位

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炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎性反应中的表达及miR-223真核表达载体的构建 被引量：6

8

作者 郝俊芳 黄凯 +2 位作者 王月影 杜丽丽 钟凯 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期183-189,共7页

小分子RNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性、非编码单链小RNA,其在乳腺组织免疫防御过程中发挥的调控作用逐渐引起了人们的关注。作者拟用qRT-PCR检测炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应中的表达变化;构建3种miR-223... 小分子RNA(miRNA)是近年来发现的一类内源性、非编码单链小RNA,其在乳腺组织免疫防御过程中发挥的调控作用逐渐引起了人们的关注。作者拟用qRT-PCR检测炎症相关miRNAs在LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞炎症反应中的表达变化;构建3种miR-223真核表达载体并检验重组载体的转染效率。用不同浓度LPS处理小鼠乳腺上皮细胞(EpH4-Ev)48h,qRT-PCR检测miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155的表达变化。以EpH4-Ev细胞基因组DNA为模板,PCR扩增pre-miR-223序列,以质粒Minicircle、pcDNA3.1(+)和转座子piggyBac为母本构建3种miR-223真核表达载体,将其转染EpH4-Ev细胞,通过观察荧光、qRT-PCR检测miR-223的表达,评价重组质粒转染效率。结果:qRT-PCR检测结果表明,LPS诱导EpH4-Ev细胞炎症反应时,4种炎症相关miRNAs的表达均显著(P<0.05或P<0.01)增加,并呈现不同程度的剂量依赖性;重组质粒转染EpH4-Ev细胞后,qRT-PCR检测结果显示,Mini-miR-223质粒转染组的miR-223表达水平无统计学差异(P>0.05);PBmiR-223和pcDNA-miR-223转染EpH4-Ev细胞后,miR-223的表达均极显著(P<0.001)增加。本研究表明炎症相关miRNAs参与LPS诱导小鼠EpH4-Ev细胞的炎性反应过程。成功构建3种miR-223真核表达载体,为后续miRNAs在乳腺炎症反应中的功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 炎症相关miRNAs 乳腺上皮细胞 LPS 真核表达载体 乳腺炎

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禽腺病毒血清4型Fiber2蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定 被引量：8

9

作者 郭瑞珍 苏冰倩 +6 位作者 王棋 王一 于朋伟 孟洁洁 齐艳丽 杨国宇 褚贝贝 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期2000-2012,共13页

旨在制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白(Fiber2)的特异性单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞... 旨在制备禽腺病毒血清4型(FAdV-4)纤突蛋白(Fiber2)的特异性单克隆抗体(MAb),本研究将原核表达的可溶性重组蛋白NusA-Fiber2作为免疫原免疫BALB/c雌鼠,筛选获得3株能稳定分泌抗FAdV-4 Fiber2蛋白MAb的杂交瘤细胞株2G5、2G8、4C2,取细胞株2G5制备腹水并纯化,利用间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)和Western blot鉴定该单抗的特异性。用制备的单抗包被酶标板,通过一系列的优化,建立了FAdV-4 Fiber2双抗夹心ELISA检测方法。通过逐步截短分析鉴定出单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明:成功获取3株单克隆细胞株2G5、2G8、4C2。MAb 2G5可与原核表达纯化的Fiber2蛋白及FAdV-4特异性反应。建立的双抗夹心ELISA检测方法具有很好的特异性、灵敏性和重复性。该MAb识别的表位序列是N端aa1—33。本研究成功制备了具有良好Western blot和IFA反应原性的单克隆抗体,为Fiber2蛋白功能研究和FAdV-4新型表位疫苗商品化研发奠定了基础。 展开更多

关键词 禽腺病毒血清4型 Fiber2蛋白 单克隆抗体 双抗夹心ELISA 表位鉴定

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猪伪狂犬病毒变异株HN1201 gB蛋白单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：3

10

作者 程璇 付朋飞 +3 位作者 杜永坤 褚贝贝 杨国宇 王江 《河南农业科学》 北大核心 2020年第10期137-142,共6页

为获得用于伪狂犬病毒(PRV)临床检测和实验室研究所需的PRV gB特异性抗体,以PRV变异病毒株PRV HN1201免疫小鼠,取免疫后小鼠脾脏细胞与SP/20细胞融合,制备抗PRV gB蛋白的单克隆抗体。经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光... 为获得用于伪狂犬病毒(PRV)临床检测和实验室研究所需的PRV gB特异性抗体,以PRV变异病毒株PRV HN1201免疫小鼠,取免疫后小鼠脾脏细胞与SP/20细胞融合,制备抗PRV gB蛋白的单克隆抗体。经免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和间接免疫荧光试验(IFA)筛选出1株稳定分泌PRV gB蛋白抗体的单克隆细胞系,经鉴定该细胞系所分泌抗体为IgG1亚型,腹水纯化抗体的IFA效价为2^-11;细胞培养上清和腹水纯化抗体用于Western blot的最佳稀释比分别为1∶50和1∶5000;杂交瘤细胞诱导小鼠腹水的中和效价为1∶25。IPMA、IFA及Western blot试验结果显示,制备的单克隆抗体能特异性识别PRV gB蛋白。 展开更多

关键词 伪狂犬病毒变异株HN1201 gB蛋白 单克隆抗体 Western blot 免疫过氧化物酶单层细胞试验 间接免疫荧光试验

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干扰素基因刺激因子基因敲除对猪伪狂犬病病毒复制的影响 被引量：4

11

作者 侯璐 王一 +9 位作者 张爽 李国利 曾磊 郭玉堃 翟云云 于朋伟 王棋 王春凤 杜永坤 万博 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期2273-2282,共10页

研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)... 研究干扰素基因刺激因子(STING)基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。用CRISPR/Cas9技术敲除猪肺巨噬细胞系(3D4/21)的STING基因,用T7核酸酶检测靶基因敲除效率,用细胞计数试剂盒检测基因敲除细胞的活力,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒PRV-GFP感染基因敲除细胞,用流式细胞术检测感染细胞的荧光强度,用定量RT-PCR检测PRV的gB、TK基因表达及其感染细胞的IL-1β、IFN-β、ISG15基因转录,用Western blot检测PRV gE蛋白表达水平,用病毒滴定法测定子代病毒滴度。结果显示:设计的3个STING基因外显子2特异sgRNA均能切割3D4/21细胞的靶序列,其中sgRNA3的基因编辑效率最高;对sgRNA1介导STING基因敲除系进行克隆化,获得基因敲除细胞系3株,基因敲除对细胞活力无影响;亲本细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占80.77%,STING基因敲除细胞培养的PRV-GFP感染阳性细胞占95.55%;STING基因敲除对PRV基因表达具有促进作用,亲本3D4/21细胞的病毒滴度为106.2 TCID50·0.1 mL^-1,STING基因敲除细胞的病毒滴度为108.3TCID50·0.1 mL^-1,病毒感染细胞的IL-1β、IFN-β和ISG15转录下调明显。STING基因敲除能促进PRV在3D4/21细胞中复制,可能与感染细胞的IL-β、IFN-β和ISG15表达抑制有关。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 干扰素基因刺激因子 猪肺巨噬细胞 伪狂犬病病毒

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抗分泌性腹泻药物的研究进展 被引量：1

12

作者 张君 王月影 +1 位作者 查光明 李和平 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第2期166-168,共3页

病理性腹泻是人和动物常见疾病症状之一,长期以来控制腹泻是医学上一个重点。基于肠病原菌及其产物诱导肠道分泌的机理,许多学者开展了相应的调控研究。肠细胞仍是直接研究和开发新药的主要焦点,随着新靶位ENS和促分泌素等发现。

关键词 腹泻 分泌 靶位 调控

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口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表达标签筛选 被引量：1

13

作者 舒静超 李赛赛 +1 位作者 申欢欢 郭豫杰 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2016年第9期114-119,共6页

为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、A... 为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、MBP,并分别将扩增的融合标签与VP1连接构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导其表达。SDS-PAGE结果表明,MBP、Grifin和GST能够促进口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,其中MBP与VP1融合表达蛋白可溶部分占60%;Western blot鉴定分析结果显示,小鼠抗His标签单克隆抗体能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了具有免疫学活性的融合蛋白MBP-VP1。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 VP1蛋白 可溶性 融合标签

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甘草酸单铵盐对蛋鸡肾功能的影响 被引量：4

14

作者 王梦珂 张才 +2 位作者 爨淑楠 邵琦 和俊豪 《河南科技大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2018年第2期71-75,共5页

为了研究甘草酸单铵盐对蛋鸡肾功能的影响,将320日龄健康海兰褐蛋鸡60只,随机分为5组。分别在饮水中添加质量浓度为0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的甘草酸单铵盐(MAG),自由采食与饮水,连续饲养21 d。试验期末检测各组... 为了研究甘草酸单铵盐对蛋鸡肾功能的影响,将320日龄健康海兰褐蛋鸡60只,随机分为5组。分别在饮水中添加质量浓度为0 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的甘草酸单铵盐(MAG),自由采食与饮水,连续饲养21 d。试验期末检测各组蛋鸡肾脏指数、血清抗氧化指标、血清尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)和尿酸(UA),并通过HE染色和TUNEL染色观察肾脏组织病理学变化。研究结果表明:与对照组相比,给药组蛋鸡肾脏指数、BUN和丙二醛(MDA)水平差异不显著(P>0.05),超氧化物歧化酶(T-SOD)活性明显升高(P<0.05),CREA和UA浓度明显降低(P<0.05),且25 mg/L组蛋鸡肾脏组织病理学改变明显减轻。 展开更多

关键词 甘草 甘草酸单铵盐 蛋鸡 肾脏损伤 抗氧化能力 细胞凋亡

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利用NusA促溶标签原核表达Butelase 1蛋白 被引量：1

15

作者 刘起涛 朱彦策 +4 位作者 王伟杰 陈佩格 孙士平 郭婉莹 郑悦亭 《江西农业学报》 CAS 2017年第3期115-119,共5页

为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析... 为获得可溶性Butelase 1蛋白,将Butelase 1基因插入到带有NusA促溶标签的原核表达载体上,将重组质粒转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,用Ni-NTA亲和层析法纯化表达的可溶性蛋白,用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白的表达情况。酶切和测序结果证实p ET21b-His6-NusA-Butelase 1原核表达载体构建成功。SDS-PAGE分析结果表明诱导后表达的融合蛋白大小为94.9 k D,主要为可溶性表达,部分为包涵体表达。Western blot检测结果显示,纯化得到的His6-NusA-Butelase 1融合蛋白用抗His6-Tag抗体鉴定时为特异性表达。 展开更多

关键词 Butelase 1 促溶标签 NUSA 表达分析

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猪LIAS基因微环表达载体的构建

16

作者 高会贞 王晓婷 +3 位作者 郭豫杰 韩立强 鲁维飞 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期380-384,共5页

为了构建猪LIAS基因长期高效的表达载体,本研究通过RT-PCR方法从猪肌肉组织中克隆了LIAS基因片段,并将该基因片段与微环表达载体minicircle进行连接,构建成微环载体minicircle-LIAS,然后转染HeLa细胞,检测其在HeLa细胞中绿色荧光蛋白的... 为了构建猪LIAS基因长期高效的表达载体,本研究通过RT-PCR方法从猪肌肉组织中克隆了LIAS基因片段,并将该基因片段与微环表达载体minicircle进行连接,构建成微环载体minicircle-LIAS,然后转染HeLa细胞,检测其在HeLa细胞中绿色荧光蛋白的持续表达时间。结果表明,本研究克隆了猪LIAS基因,该基因长度为1 119bp,并将该基因成功构建到了微环表达载体minicircle上;转染HeLa细胞对绿色荧光蛋白持续表达时间的观察显示,构建的微环表达载体minicircle-LIAS中绿色荧光蛋白的持续表达时间明显高于常用的pEGFP-N1质粒,为进一步阐明LIAS合成的生化过程及功能调控提供了新思路和试验材料。 展开更多

关键词 猪 硫辛酸合成酶 基因 微环表达载体 HELA细胞

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猪lipasin基因的克隆及其对肝细胞LPL基因转录的影响

17

作者 李曼曼 温丙言 +3 位作者 朱河水 钟凯 杨国宇 王月影 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期411-416,共6页

旨在克隆猪lipasin基因,并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因,构建其真核表达载体转入肝细胞,探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明,成功克隆了猪lipasin基因,目的片段大小为615bp,上传至G... 旨在克隆猪lipasin基因,并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因,构建其真核表达载体转入肝细胞,探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明,成功克隆了猪lipasin基因,目的片段大小为615bp,上传至GenBank(登录号:KF017598),开放阅读框为594bp,编码197个氨基酸,liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99ku和6.79;成功构建了真核表达载体PB-EGFP-lipasin,实现lipasin基因在肝细胞中的过表达,与对照组相比,PB-EGFP-lipasin转染的细胞中LPL基因的转录水平显著下降。结果提示,猪lipasin可能通过抑制肝细胞LPL的转录影响脂代谢。 展开更多

关键词 lipasin 猪 克隆 肝细胞 LPL

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猴源cathepsin基因shRNA文库及其稳定敲减细胞系的构建

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作者 魏宇双 刘姣扬 +7 位作者 韩莹倩 郭珍珍 刘晓贺 巴根 韩立强 王江 褚贝贝 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1282-1290,共9页

目前关于组织蛋白酶(cathepsin)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)生活周期中发挥功能的研究较少。为了探究宿主细胞中cathepsin在PRRSV吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装以及释放... 目前关于组织蛋白酶(cathepsin)在猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)生活周期中发挥功能的研究较少。为了探究宿主细胞中cathepsin在PRRSV吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装以及释放过程中的作用,选取源于MA-104的非洲绿猴胚胎肾上皮细胞Marc145细胞系(对PRRSV易感);利用RNAi原理,构建了以pLKO.1为载体的cathepsin基因shRNA文库;并用puromycin筛选出稳定敲减cathepsin的细胞株。结果显示:本试验构建的cathepsin-shRNA文库包含45个克隆,涉及15种cathepsin基因,筛选出的稳定细胞株中相应cathepsin基因mRNA的表达量均有显著下降。这些细胞株的构建为进一步研究cathepsin在PRRSV生活周期中发挥的重要功能奠定了基础。 展开更多

关键词 CATHEPSIN SHRNA Marc145 慢病毒 稳定敲减细胞系

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猪TRIM11基因克隆及其促进猪伪狂犬病毒在体外增殖的研究

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作者 宋爽 曾磊 +7 位作者 鲁绍芳 郭珍珍 鲁维飞 韩立强 王江 王月影 褚贝贝 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期1239-1246,共8页

为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂... 为初步研究猪TRIM11的免疫学功能,以猪颌下淋巴结cDNA为模板扩增TRIM11基因cDNA并对该基因进行了蛋白质结构预测和组织表达谱分析,将该基因与PiggyBac载体相连获得真核表达载体PB-TRIM11,之后转染PK15细胞获得稳定表达细胞系。用猪伪狂犬病毒(PRV)刺激过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞后,于不同时间收获细胞上清,比较两组细胞上清中病毒滴度变化。结果表明,猪TRIM11的ORF长度为1 407bp,编码468个氨基酸,该氨基酸序列含有3个TRIM家族保守的结构域。组织表达谱分析显示,猪TRIM11在脂肪组织、肺的表达量较高,而在心、回肠、十二指肠、直肠中的转录量较低。成功克隆了猪TRIM11cDNA序列并构建了真核转录载体PB-TRIM11,qRT-PCR检测结果表明TRIM11在PK15细胞系中成功表达。检测感染PRV后过表达TRIM11PK15细胞和对照组细胞上清液病毒的TCID50发现过表达TRIM11组的病毒滴度始终高于对照组。过表达TRIM11有一定的促进PRV增殖的作用,为进一步研究猪TRIM11在天然免疫中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 三基序结合蛋白 猪伪狂犬病毒 病毒增殖 稳定细胞系

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霍乱弧菌DncV蛋白的原核表达及活性分析

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作者 韩莹倩 孔江南 +2 位作者 王江 张超 杨国宇 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期868-872,共5页

DncV(VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶,其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和cGAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使,通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备cdi-GMP用于深入研究其功能,构建了VC0179融合che... DncV(VC0179)是在霍乱弧菌中发现的一种双核苷酸环化酶,其可以合成c-di-AMP、c-di-GMP和cGAMP。研究发现c-di-GMP作为胞内的第二信使,通过STING信号通路激活先天性免疫应答。为了体外制备cdi-GMP用于深入研究其功能,构建了VC0179融合cherry标签的丙酸诱导型表达载体,并将该重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。利用丙酸钠诱导表达后,观察菌体颜色是否为红色判断融合蛋白质的表达。超声破碎细菌后经SDS-PAGE电泳检测融合蛋白质的可溶性表达。最后通过Ni-NTA Agarose亲和纯化重组蛋白质,获得的重组蛋白质进行体外酶促反应,高效液相色谱检测合成产物c-di-GMP。结果表明:成功构建VC0179丙酸诱导型原核表达载体并获得了高纯度的VC0179重组蛋白质。该重组蛋白质通过体外酶促反应可一步生成c-di-GMP。本试验建立了稳定获得具有酶活性的VC0179重组蛋白质的方法;c-di-GMP的体外合成为其后续功能研究及大量制备奠定基础。 展开更多

关键词 VC0179 C-DI-GMP 原核表达 酶促合成法 高效液相色谱

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